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体细胞的重编程可通过 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc or Oct4/Sox2/Nanog/LIN28的病毒转染法而实现，最近又有报道仅用 Oct4/Klf4便将神经祖细胞重编程为ipsc，这是因为NPC可内源性表达OCT4.这篇研究中，我们用小分子BIX-01294 and BayK8644联合病毒转染Oct4/Klf4入小鼠的成纤维细胞，该细胞没有相关的内源性基因的表达，也得到了ipsc，说明通phenotypic screen得到的小分子能够替代病毒转染用的一些因子如OCT4，并且提高了重编程的效率（相比于去掉c-Myc的Oct4/Sox2/Klf4方法）
& n7 s; J2 c1 P" ? Q! F0 r BIX 与Bayk 的作用机制：
: @4 u/ E A5 {- L 1、BIX: 在NPC的诱导试验中，进一步的研究表明在此过程中，G9a histone甲基转移酶受到抑制(G9a HMTase)后，重编程的水平大大提高了，BIX便是G9a HMTase的一种抑制剂，
) E8 ?) E, D8 k" a- R/ V: H! s( I; N9 H! M$ L
2、Bayk 是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用。L-type calcium channels 在细胞内的不同组织内介导一系列的过程，如blood pressure regulation, smooth-muscle contractility, insulin secretion, cardiac development, 其通过CREB作用使Ca2+释放，改变cAMP水平，此外，Ca2+在mESCDE 增殖过程中也有着重要作用。
/ T/ c) t4 C( c! s9 u3 }) B% g
' O' J- a) J# Q: i0 F, R! y BIX-01294 、BayK8644、Oct4和Klf4共同作用与小鼠的成纤维细胞的结果：! ^7 L9 V- E+ F5 a' H4 v5 T
仅用OCT4和Klf4得到的ipsc形态不明显，ALP也很弱，而且无法扩增，
* x0 S/ {+ B( \" H 用OCT4和Klf4加上BIX处理，在此之后的14-21天内，得到强表达ALP的克隆，而且Nanog, Oct4, and SSEA-1也呈阳性，但其诱导率明显低于 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 4因子诱导和OCT4、Klf4、BIX联合诱导 NPC的过程，这个结果表明表观修饰在重编程的过程中也起着重要的作用。
# p% Z( }* z- X 在OCT4和Klf4加上BIX的基础上，又添加了其它的小分子，结果又发现了5-azacytidine、RG108和BayK，前二者与BIX相似，是 DNA methyltransferase的抑制剂，后者是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用，而且在无BIX处理的过程中，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK是无法引起重编程的。
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进一步确定其多能性
% T$ D% R4 c3 f1 t# x 用含Oct4-GFP reporter的MEF为材料，结果与上述相似，即仅用OCT4和Klf4、用OCT4和Klf4加上BIX处理时得到很少的克隆。用OCT4和Klf4加上BIX、BayK处理时得到较多的克隆，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK无克隆形成。
+ {$ k) m' A) Y+ W M/ S$ u 检测其多能性： o! Z' X0 f" T4 u5 E/ N; k6 Y
1、DAPI、APK染色和 RT-PCR显示这些GFP+OK2B iPSCs 表达了典型的多能性标记： ALP, Nanog, Sox2, Oct4,SSEA1, c-Myc, eRas, Esg1, Ecat1, and Fgf4.
4 ^# p* t8 j7 _# W& o2、Bisulphite genomic分析Nanog 启动子的去甲基化程度与ESC相当，与MEF想去甚远。+ Y& \/ u* g2 t: y* V
3、Transcriptome分析analysis showed that expression profile of OK2B iPSCs is greatly similar to the one of mESCs with a Pearson correlation value of 0.96, while significantly different to MEFs’ profile with a Pearson correlation value of 0.84 as exemplified in the clustering analysis
% n9 n7 F" m! J, N; f- C% v8 P4、分化潜能:: R1 ?! u3 X: ^, B2 d1 q8 K4 E" c
（1） 类胚体实验：对得到的EB用DAPI染色，显示三胚层均有分化：内胚层 (Albumin and Pdx1),中胚层 /心肌(CT3), 外胚层/neurons (bIII-tubulin, Tuj1).
" m: h f# N) [- [( V, J （2）2N囊胚注射：将ipsc注入8细胞期的囊胚中，再移植入同期的小鼠子宫中得到嵌合体小鼠，将得到的一个雄性嵌合体小鼠与野生型雌鼠杂交，得到的后代小鼠中得到了有LacZ+和Oct4-GFP+细胞的小鼠，说明该ipsc能整合到生殖系产生精子，证明了其全能性。 |
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发表于 2011-2-12 20:53
发表于 2011-2-12 21:02
