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标题: 脐带贴块法间充质干细胞培养原代细胞生长少 [打印本页]

作者: jifengtang 时间: 2015-12-29 20:49 标题: 脐带贴块法间充质干细胞培养原代细胞生长少

最近一直养脐带MSC，采用贴块法培养，但细胞长得不好，T175一瓶贴块约50块，只有2~3块爬出细胞，请教是什么问题？
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具体操作：
1、脐带PBS+双抗洗后处理，剥离血管。 G- m$ X8 B$ U' ]/ i
2、洗洗剪碎成2mm3左右小块。% f8 L7 q: a$ N1 g
3、培养瓶用培养液润洗过。$ D, p5 P( W5 [( s. s: e
4、放好块倒置培养过夜，T175补液至20ml，每5天换液一次。) I5 U! h) V" e/ q* C6 E
5、培养液：DMEM+FBS+双抗。% E& N( Q2 y* N0 W$ n

作者: 木头1102 时间: 2015-12-30 09:09

有可能是脐带的个体差异，或者放置时间过长；培养液如果配好之后放在4度冰箱时间长了，效果也不好。你是第几天观察到2-3块爬出细胞的，如果时间不是很长，可以在等等；如果时间挺长了，就传了吧，注意传代时细胞密度，可以把瓶里的组织块二次贴壁或者消化了，看能不能再获得点细胞。还有就是，组织块贴壁法最好只用华通氏胶。

作者: jenny114402 时间: 2015-12-30 09:23

我们都用皿培养，你可以试试悬浮法培养，操作简单，正常基本7，8天长出细胞吧

作者: haibara007007 时间: 2015-12-30 10:25

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你可以试试把脐带剪得再碎一些，多贴一些，应该会比较好，我们现在都贴很小很多块，贴三个75t，这样基本都可以爬出来

作者: 张杉杉 时间: 2015-12-30 10:36

我也是新手，刚刚开始养脐带间充质干细胞，静置7天后观察，一个细胞都没长。不知道是脐带原因还是什么？

作者: jifengtang 时间: 2015-12-30 11:33

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基本是9~11天有细胞爬出，2~3块，然后一周后还是只有这2、3块有细胞，其他爬不出来。做了好几个脐带都这样。个体差异是不是和母体有关，我做的母体年龄较大，都在30岁以上？

作者: jifengtang 时间: 2015-12-30 11:34

回复 jenny114402 的帖子! Z, A9 @ q K" {3 X
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悬浮法？是指酶解法吗？

作者: jifengtang 时间: 2015-12-30 11:35

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大概多碎？我现在剪成大概芝麻粒大小，再请教下。贴完后补液换液你是怎么操作的，我基本前3天补一点点保持湿润，第四天没块。

作者: jifengtang 时间: 2015-12-30 11:36

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培养液，血清用的什么？

作者: 张杉杉 时间: 2015-12-30 14:53

回复 jifengtang 的帖子/ r) ~; o2 D9 X3 W
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培养液用的HyClone的α-MEM培养基，Gibco的血清。已经静置培养7天，第八天换液后，又静置四天，今天观察培养基颜色，没有变化。

作者: jenny114402 时间: 2015-12-31 09:02

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不是，就是不让把组织块贴壁1小时这个步骤省了

作者: haibara007007 时间: 2015-12-31 11:08

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这样应该没什么问题，记得每天观察，注意液面就好

作者: zsykdx 时间: 2016-1-4 10:45

第三步，你试一下不要润洗，我们实验室培养都不润洗，直接在皿上铺开组织块，然后再加培养基，这样的话组织块贴壁效果好一点，爬出的细胞会比较多。

作者: yooung 时间: 2016-1-4 14:55

用T175培养瓶有点浪费哟

，T75就可以了。T175培养瓶才铺50块，有点少。组织块3~5mm间隔就可以了。% g) ?8 r9 G s G: ~6 p2 a7 X! W( z
不用润湿，贴好后竖直放置，再加入几ml培养液，竖直放置在培养箱3、4小时，再平躺轻晃润湿组织块，隔天补加培养基，就可以了。

作者: jifengtang 时间: 2016-1-5 10:41

回复 zsykdx 的帖子 j* M3 B' E# A6 O

不润瓶的话，贴块后多久开始补液，补液几次，没次多少？

作者: tlms1991 时间: 2016-1-5 16:26

回复 jenny114402 的帖子1 d w% t1 F, L, k
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你好，悬浮法培养是怎样的？？？求赐教！！！

作者: tlms1991 时间: 2016-1-5 16:26

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你好，悬浮法培养是怎样的？？？求赐教！！！

作者: jenny114402 时间: 2016-1-6 11:56

回复 tlms1991 的帖子4 C8 k8 C( Z: A) ^3 T% x/ v0 K

悬浮法就是将剪好的组织块直接分到皿里，然后每皿加8ml 的无血清培养，搅拌让组织块分散，然后就放培养箱培养，省去贴壁这一步骤；培养过程中组织块可能自己会贴壁，那就让它贴吧。

作者: 张杉杉 时间: 2016-1-6 14:20

我的脐带间充质干细胞在12天的时候都长出来啦。在第八天的时候一半半量换液，一半直接加了半量培养基。如果按论坛里大家的说法的话，培养基多的话不利于贴壁长细胞，但是发现直接加培养基的反而细胞长出来的多很多，疑问？

作者: 细胞海洋 时间: 2016-1-7 12:51

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建议你发新帖提问

作者: jndxdff 时间: 2016-1-7 16:43

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你好，请问华通氏胶如何分离

作者: 细胞海洋 时间: 2016-1-8 13:34

回复 jndxdff 的帖子& W0 k6 H2 ?' n& R4 v0 T, h

搜索论坛很多这方面的内容

作者: 1195963542 时间: 2016-1-8 20:43

1.剪得可能不够碎
2.每2-3天观察一下细胞形态、数量和培养基的状态，然后补液或换液

作者: 1195963542 时间: 2016-1-8 20:46

回复木头1102 的帖子0 L l; \( x% w

请问华通氏胶怎么从脐带上分离出来呢肉眼观察颜色都比较浅怎么辨别呢

作者: 1195963542 时间: 2016-1-8 20:49

回复张杉杉的帖子
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期间定期观察细胞状态，看看细胞生长情况，培养基状态需要换液或加液

作者: 1195963542 时间: 2016-1-8 20:52

回复 jifengtang 的帖子- f3 |) @/ u1 d9 ~, V" {
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不是两者独立悬浮法比较简单酶解法操作麻烦点

作者: jenny114402 时间: 2016-1-11 09:02

回复 jndxdff 的帖子5 Q% ? `/ {! ^

肉眼还是能看出来的，一般华通胶是发黄透明，羊膜比较白，一条一条撕下来，我有时不分离羊膜和华通胶，细胞一般10天也能爬出来

作者: duwenjing 时间: 2016-1-12 21:44

我是把华通胶剥离剪碎做组织块铁贴壁

作者: haibara007007 时间: 2016-1-19 14:58

回复 jifengtang 的帖子- |% n& `: u; ]0 I: u1 o5 O F
7 {- r' l/ D& G' l$ e. m
这个大小可以，可以多贴点，在75t瓶中，67十都可以，你可以第一天换一次半量，3-5再换一次，你可以试试

作者: tingting2113 时间: 2016-1-20 09:22

回复 jifengtang 的帖子- T) O* }( C3 w+ A

1、可以多贴一些组织块；
2、时间：一般一周左右出细胞，如果时间不够再等等，只要不污染基本都会有细胞；6 T0 G" \& X- ?. l* e' [2 e
3、组织要用华通氏胶，好贴而且不容易出现杂细胞。
我的方案7 r N) H* y& ^' Z( b$ g% Y
1、脐带剪段，生理盐水洗，不用双抗
2、除去动脉和静脉血管，撕华通氏胶（如果有血迹，再用生理盐水洗）
3、胶在离心管中剪碎+ W; P: f7 n# i* F; x4 s4 }* O
4、用培养液悬起组织块，加入培养瓶（皿）. `: N0 q. {0 ?* v0 d+ d- ]
5、补加合适量的培养液，培养

作者: ghx2005 时间: 2016-1-22 15:16

注意铁壁组织块的大小，芝麻大小估计是太小了，破坏了太多细胞结构，再就是倒置培养的时间不要太长

作者: 孤独山石 时间: 2018-11-14 08:43

DMEM培养基不好吧营养糖分太高容易老化吧+ d7 b4 t) C$ m P g. P0 B

作者: caoyue 时间: 2018-11-22 14:37

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剪这么小，接种的时候也这么小一块吗？有的时候接种块过小也不愿意爬细胞，可能本身里面就没有。

作者: xyzwt1984 时间: 2019-1-14 15:52

组织块剪得过小，破坏组织结构，加了培养基后也容易飘起来，影响组织块贴壁。

作者: 大胖子阿哥 时间: 2019-1-24 15:25

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兄弟你才贴50块块太大了吧我们这都200-300

作者: 大胖子阿哥 时间: 2019-1-24 15:26

回复 jifengtang 的帖子6 C* D8 T% ?% C- ?! \1 p

你才贴50块块太大了吧我们这都200-300

作者: 杨宗繁 时间: 2019-2-12 14:44

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你不先把华通氏胶先剥离出来再剪碎吗？

作者: Panda芹菜 时间: 2019-2-23 16:00

回复 jenny114402 的帖子' P& e) g$ }9 A- s! u' P0 J
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前辈您好！您应该是悬浮法分离脐带间充质干细胞的行家了！希望能跟您请教一下，悬浮培养过程中的换液时间和方法，以及您用的培养基厂家，期待您的回复！

作者: Panda芹菜 时间: 2019-2-23 16:11

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前辈您好！能麻烦您说一下组织块悬浮培养几天后补液加液吗？能否推荐一个好的培养基厂家？先谢谢您啦！

作者: thomassun2008 时间: 2019-3-20 21:45

本帖最后由 thomassun2008 于 2019-3-20 21:46 编辑
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剪成肉糜状，1-3mm块，第一天接种加少量液体促进贴壁，3天后补全量液体，平常细胞放培养箱少去看皿，10天左右，贴20块就会有5块左右爬出来。我用的lonza加pall的解决方案+bFGF

作者: 屋檐上的乌鸦 时间: 2019-3-25 15:32

本帖最后由屋檐上的乌鸦于 2019-3-25 15:33 编辑
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我刚开始也有上面新手说的问题，后来我的解决方法是：去除血管，尽可能多的获得华通氏胶，然后剪碎。将尽可能碎的胶置于T75培养瓶中，加少量培养液（1-2ml），湿润各个胶即可，等3-4个小时，观察胶是否粘附在瓶底（注意动作一定要轻，防止未粘附的胶滑动），如果都粘附了，则再次加入（1-2ml），第二天观察贴壁情况，再次补液至7ml。静待细胞爬出来~~~
希望能对各位有所帮助。

作者: tgfdstemcell 时间: 2020-4-3 10:21

不要剪的太碎了不好贴壁

作者: tgfdstemcell 时间: 2020-4-3 10:22

可以撕成条状贴后补液注意控制好时间

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