干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 求助流式细胞仪使用步骤及注意事项 [打印本页]

---

作者: 1195963542    时间: 2016-1-8 00:58     标题: 求助流式细胞仪使用步骤及注意事项

0 Z1 ?& o0 S7 V' L
" h/ n# F( B. {3 j
求助流式细胞仪使用步骤及注意事项     以及结论分析，视频或者详细步骤的文献均可

---

作者: 小猫狸狸    时间: 2016-1-8 08:26


7 n" M. p& L* q6 Z, O" b8 j0 Z7 P
2 f! W7 g% ~* ?5 W' D一、开机程序! u  ?7 ^$ J" D- d0 ?; D
　　
% {- ]; s* j4 R; F　　1、检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟.
% k: i% N+ q8 _' _- K- k　　# [' B% S2 F% D% o' r5 ?  C
　　2、打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400ml漂白水原液.打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow）,合上压力阀.确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置.
* V% F! @" N, L0 d7 l1 q　　
- p: ^' S: l  b　　3、将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5－10分钟.排出过滤器内的气泡.9 E2 _' p) w! S
　　9 g7 F, f' q$ e9 D4 P9 f+ [; o3 s( |
　　4、如果需要打印,打开打印机电源.
2 x6 O$ g% C" S　　
$ g( D, H6 C2 v5 I- D+ }9 V9 P& Z6 J　　5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志.
/ w$ L! l' t( L2 S% V# S' g　　/ V' b* `* B8 |: O, S2 l
　　6、执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡.& q# B; @2 Z" C9 _& b% P
　　
  z% R- W, f. o0 R/ ]" y* N　　7、分析样品时,先用FACAFlow或PBS进行HIGHRUN约2分钟.
3 Y" B, A! t7 E. C; G- V　　# l8 `4 f& O$ v/ V5 Q5 i- k
　　做过分选后,每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗.待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次.
, A! n, J% \: p　　
: x; e! o. p* F* s2 u$ b9 J　　二、预设获取模式文件（AcquisitionTemplateFiles）
6 V/ g7 I: s, s! W# v! [　　6 B2 C- E6 w8 {' b
　　1、从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件.! x% u+ @4 l4 l  V! W' u
　　% J0 X* k9 `* o, V8 s; V- \
　　2、选取屏幕左列绘图工具中的Dotplot,绘出一个或多个DotPlots（点图）.从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数.+ p/ W7 {/ j5 Z8 Y
　　
: A+ k  B, S3 O　　3、选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram（直方图）.* ^8 O* P, @+ B
　　: J! E: @( o. N# I
　　4、将此视窗命名后储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用.7 \  W  L+ s0 v  ~/ j
　　
8 A6 H$ J5 y1 \9 d! ?　　本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP,储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析.; m& U4 ^, L& a! ]3 b% j
　　
' V! C% b: A& u$ X　　三、用CELLQuest进行仪器的设定和调整* c+ a' c/ c% m% O" Y8 T  X
　　
" o5 l5 _3 j3 K" }5 w. C　　1、从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件.
  O( g& V9 J4 l8 q5 W　　
7 y: p  F: F7 f$ ~% Z7 T　　2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.
8 l2 |; v; C0 k, p* a" y- `　　
# d. V- p+ p9 ^3 }! z1 _　　3、从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件.也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框.& L% i# f( Y! Y7 b- t7 M4 i
　　4 F+ I: _( T! I" H
　　4、在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）：线性模式Lin或对数模式Log.一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMParam选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMParam选择FL2；分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量.; w  i, |$ y  S% R
　　$ H. R& D) Z$ v4 R0 F9 o
　　5、放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上.( Q- M* N' T( j% _9 J& O
　　& K7 M6 S% N% |5 a8 M% y. ~7 p
　　6、在AcquisitonControl对话框中,选取Acquire,开始获取细胞.在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果.未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“?”.
- R9 G( k# c3 L2 x8 L* n# F: [" Q　　
/ ^2 ]$ b6 T4 Q& w1 f　　7、在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMTvoltages（粗调）与AmpGains（细调）,使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布.) D) Z$ o( R# s. o. L
　　9 o. b! f1 W& b% R
　　8、在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号（细胞碎片）.一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H.Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量.
- S! I: u/ s- J, j　　5 P+ q2 k& C6 L) v
　　9、从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域）,并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门.圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易.
6 w9 L% |! U' z7 ]' q8 {　　' m/ h/ ~1 R# {3 K; ~) X
　　10、在Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度.根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内.
5 Z+ m. x8 h3 V9 [8 @2 [　　; ?+ ]( m& `) A+ E6 Q4 [( A* {
　　11、在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿.比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内,则需调大FL2－？％FL1中的“？”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
: n( J  A( r6 J% ~　　4 d$ p1 \5 ^' `, }0 ~; T
　　12、在Status对话框中可见：LaserPower:正常值—Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW；Lasercurrent:正常值为6Amps左右.( X  c9 c, \2 N0 b8 D+ X
　　
7 Y9 G7 r- X- i7 P- U4 q6 R　　13、调整好的仪器设定可在InstrumentSettings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可.
! b( `8 U) [2 @$ b　　
$ V7 W1 B! K! c9 ~% u% I　　本计算机中已有三个名叫储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderIMM-InstrSettings及FACStationG3BDFilesInstrumentSettingsFilesCalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞.
! x* @/ b( I, q; o+ \' h& d　　. c! S/ |$ f( g: T; q) G3 ]
　　四、通过预设的获取模式文件进行样品分析& x! r, P2 P: a
　　% V6 T5 u) f1 g8 F! \7 q, a( Y5 C
　　1、从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open,打开预设的获取模式文件.% M& T( a* X$ i' g: I) R# t
　　9 d6 o) V+ l9 o
　　2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.
) G& f( G. H, ~) U* q　　9 z3 F. F8 ^2 p2 S6 s) v
　　3、从Cytometer指令栏中选取InstrumentSettings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定,按Set确定.
0 t# u' h9 d2 ?! ~, _- o2 D　　
; e7 S+ z0 T, n　　4、在Acquire指令栏中,选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数,参数,信号道数.其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024.ParameterSaved…则根据不同的检测对象选择不同的参数.
+ X! I6 c5 r! |  o$ Q　　
0 Z% l; a5 I% K/ C; A9 A　　5、在Acquire指令栏中,选择ParameterDescription,以决定文件存储位置（folder）,文件名称（file）,样品代号以及各种参数的标记（panel）,即安排tube1,2,3…的检测参数.一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DNA文件夹中.文件根据日期命名.+ Q: K3 `0 J& L, F' I. c/ g1 b
　　
) a5 \; J" s7 ?! u+ M5 |. y　　6、在Cytometer指令栏中,选择Counters,将此对话框移至合适位置,以便于随时观察events计数.
  m8 y  T& P* o4 i; k　　3 w$ |: Y! s& Y. y4 }% Z; f$ x
　　7、将样品试管放至检测区,在AcquireControl对话框中选取Acquire以启动样品分析测定.
5 s7 s9 t. `, V' V　　
, \$ |  I$ U! ~# L8 P　　8、微调仪器设定,待细胞群分布合适后选择AcquireControl对话框中Pause,Abort,去除Setup前的“?”,开始正式获取信号,存储数据.
5 Q: {9 F! E% x7 N6 w$ t　　6 z3 `( V# V/ r+ W6 M
　　9、当一定数目的细胞被测定后,获取会自动停止,并会自动存储数据.重复步骤7,继续分析下一个样品,直到所有的样品数据分析完毕.# Q! h# O' v1 O
　　* b: J; Q: p2 g9 G4 ?% t' o; A# G7 s8 ?
　　当所有样品分析分析完毕,即换上三蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态,以保护激光管.3 e# c$ \6 h' T/ O
　　
* m3 n- M5 K0 _  k　　五、关机程序( [. W* s. B# b  ]9 b2 p
　　
1 n( K) g, N1 ]; e- }* B" d　　1、从File中选择Quit,退出软件,选择Don’tSave至苹果屏幕.
1 M8 h' a, f1 ]2 V　　
0 R0 M% T, X4 k8 i3 |: M　　2、用4ml1：10稀释的漂白水作样品,将样品置于旁位（vacuumison）,以外管吸去约2ml,在将样品架置于中位（vacuumisoff）,再HIGHRUN5分钟（内管吸去2ml）.( ^  `4 j6 c+ \# n
　　
. [! b- o8 U6 b' q* G* l3 ~5 h, C. a7 ~　　3、改用三蒸水4ml作样品,同上处理.
3 O3 t  J( w5 Q. C　　- h2 F8 W' ~6 k* f9 H1 s
　　4、按Prime三次.5 w3 u( {+ N* Z
　　
- {0 l6 ]1 D4 r4 B4 J' U  X　　5、此时仪器自动转为STANDBY状态,换2ml三蒸水.必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源,以延长激光管寿命,并确保应用软件的正常运行.$ c/ \' q5 d. s# b% T
　　
# t1 t: }  I5 X! ~% t; F　　6、填写使用登记表.
' Y/ ?! J$ j) q; g3 t1 Q+ Z& n' `6 s$ ~$ ^5 J( e5 p1 U

% {7 i- I) U$ f0 x, F' D% c

---

作者: 1195963542    时间: 2016-1-8 10:32

回复 小猫狸狸 的帖子) h7 X8 i4 a5 B' n2 `

5 t" C) J8 z! i, B! A非常感谢    新手必备啊  

---

欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)

Powered by Discuz! X1.5