5 p1 s* @3 N. c% a v" ^+ ] 1、检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟. 4 V, F" w' k f6 C5 M" M" S * d: Q! O6 a- E 2、打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400ml漂白水原液.打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow）,合上压力阀.确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置.: u* C4 ^2 F5 \$ }1 H
1 \9 i$ ]/ [% M- Y0 l' Q
3、将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5－10分钟.排出过滤器内的气泡. , q4 a; o! C, E0 d$ E! y % C# g4 J' t$ u) x0 C$ P) D5 V
4、如果需要打印,打开打印机电源. ) [) A% A* G1 Q( V $ O; T) T, J0 Q" h$ f1 V, s 5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志. 5 s! J/ Z6 }( k: `. e( Z 8 Z" u1 C5 @" X5 O; } 6、执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡.2 O9 v, j* g- B( E( N
% I$ ~% _ f/ A
7、分析样品时,先用FACAFlow或PBS进行HIGHRUN约2分钟.5 e8 D6 L$ F2 a/ a& L: W2 t/ }1 Z
% K8 v3 Q! [8 z, m) q; w, ?- y
做过分选后,每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗.待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次. P! J* z5 j/ r4 B# q ! E, G. k- z# p( ]5 a% ~- g4 a 二、预设获取模式文件（AcquisitionTemplateFiles） 9 u' f }& H2 m0 a$ w8 |" o' R 0 e4 Z3 s$ c. ]" ^
1、从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件. ) a9 g+ l3 Z! A9 L6 X * h9 {2 x+ J% \# F# W! t' ?
2、选取屏幕左列绘图工具中的Dotplot,绘出一个或多个DotPlots（点图）.从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数. * @7 ~4 A3 P! s5 l; A1 @7 w8 ~2 { 1 V2 v0 J* e# I8 t6 ~- J
3、选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram（直方图）.9 T) b* L5 J6 e0 s
( E, [/ ?4 O3 S9 M* ]# c 4、将此视窗命名后储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用.5 A- T& L+ y/ D# A
5 x! S& S/ t7 V 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP,储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析.# V& {1 O. A' e" C ?: _
2 H* Y7 e! X1 u- V
三、用CELLQuest进行仪器的设定和调整 8 Y, s. D2 _3 u7 y$ D( s ) {6 @ G5 f7 L/ N8 S+ |
1、从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件., y8 L( X* R4 P, V( O4 u. q+ X
& `, N/ L$ Y, `5 x s* a7 G+ v 2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置. 4 z; u# [2 m; `5 w & u+ `) D+ f& O! M
3、从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件.也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框.: U3 Q- u0 K/ T
8 X# c' K; u' ^ 4、在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）：线性模式Lin或对数模式Log.一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMParam选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMParam选择FL2；分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量.) t3 B8 r, X0 |' i; Q; x0 B
& C; R8 {3 q' |9 B6 C7 a8 Z0 n t9 l
5、放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上.% E# x O4 J4 w
! n1 l0 \5 [' {- w6 n
6、在AcquisitonControl对话框中,选取Acquire,开始获取细胞.在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果.未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“?”. ! {* q2 M0 J5 i" G; f % ?+ z" G6 p3 j, }8 Q' _% D 7、在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMTvoltages（粗调）与AmpGains（细调）,使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布.: v) w. O+ T" u" \2 |/ b. m
( a+ p5 s6 D+ ^$ m' [8 n9 A0 u0 T! r0 A
8、在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号（细胞碎片）.一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H.Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量.% r9 q, a: j' O+ Y# C9 s& [3 @: X @9 d! G# Q
7 D& m% j7 E5 l+ H
9、从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域）,并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门.圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易.2 a; H6 |& m7 b/ t. J. o
" o8 j& f9 r4 s( `. L 10、在Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度.根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内.- X3 m) S" l# T7 E% _$ r
* x9 U, u% O, {! q0 V; A; ~2 Q 11、在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿.比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内,则需调大FL2－？％FL1中的“？”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当 @- ], w2 W- R- d; k( m
$ f- V, a& C0 D* Z# d5 d) w' @ 12、在Status对话框中可见：LaserPower:正常值—Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW；Lasercurrent:正常值为6Amps左右.' C( D2 T, O, S
. }( b% R/ C$ O+ ~1 [
13、调整好的仪器设定可在InstrumentSettings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可. , [ c5 r9 C( k" j X2 e3 z8 p6 c
本计算机中已有三个名叫储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderIMM-InstrSettings及FACStationG3BDFilesInstrumentSettingsFilesCalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞.& h8 f1 z; @( R3 H' B) q0 J
# {) R0 D. A0 K+ J6 L6 {/ C0 f 四、通过预设的获取模式文件进行样品分析 & _# s: R+ y8 ~ C; f* H* O" b* S" _% f
1、从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open,打开预设的获取模式文件. ' X$ t- x, m# O4 g ' ~1 K. L2 N0 P/ f# v6 q. l" o 2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.5 C- b7 E' \" B% q% F6 T
# [4 q; i4 a. I. Y9 a9 F; ?
3、从Cytometer指令栏中选取InstrumentSettings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定,按Set确定.( H" V$ n" Q6 e A