干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 跑胶出现三条带？ [打印本页]
作者: gxbzjznn    时间: 2016-1-11 22:19     标题: 跑胶出现三条带？

P基因跑胶SOX2居然出现三条带？大家帮我分析一下我的这张电泳图毛病（任何毛病的地方都可以），欢迎批评指导

图片附件: QQ图片20160111222116.jpg (2016-1-11 22:18, 94.17 KB) / 下载次数 247
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NzQ3NTZ8NjMzZWM3MWZ8MTc1MDUxNTgwNnww

作者: thinktank    时间: 2016-1-11 23:06

楼主没有交代清楚问题。
作者: thinktank    时间: 2016-1-11 23:08

最下面的一条带是引物二聚体，中间的可能是非特异性扩增。
作者: baby00000003    时间: 2016-1-12 08:28

50bp的是dimer吧，更前端的那个，猜不出
作者: lgfffancy    时间: 2016-1-12 09:18

最小的那个是引物二聚体
作者: king8    时间: 2016-1-12 09:19

同意thinktank的说法，最下面的条带是引物二聚体，中间的是非特异性扩增
作者: nichifanlema2    时间: 2016-1-12 10:12

回复 gxbzjznn 的帖子* M4 K: |! m7 @' P! y; S
3 @9 {( C4 j0 @9 r5 a" Y
中间的是引物二聚体，因为在50左右，你的引物大概是20-30bp吧，最小面的应该是你的引物单链，说明你PCR的时候引物浓度太大，导致引物染色和二聚体特别明显。建议降低PCR时引物浓度。
+ q( ]' D+ p2 ?marker还是挺不错的，是哪个品牌的？
作者: 云飘过的思念    时间: 2016-1-12 13:15

本帖最后由 云飘过的思念 于 2016-1-12 13:16 编辑
8 ^7 S4 c! A( c* \" Q( `8 x
0 n3 I* s- h4 N- y条带的问题相信楼上的各位老师已经帮您分析得很清楚了，我不再多说，对于胶染法个人认为不需要像这样过曝光，这样的话会提升了背景值，若染料为EB的话会发现在紫外下仍有染料的部分呈现粉红色，反观整体胶的轮廓不难发现下沿的轮廓不清晰，这样的曝光强度会对某些成像分析定量有影响，建议楼主能够看清条带及非特异情况和二聚体的强度为准尽量的降低背景值的干扰，依靠分析软件标定的定量条带亮度对样品浓度进行定量分析。
8 s) h7 f) b2 C9 }- f3 v; f$ ~! u略有拙见，各位勿喷啊
作者: gxbzjznn    时间: 2016-1-13 22:24

回复 nichifanlema2 的帖子
2 C. V2 u/ g- K7 x" R
" |1 L: L0 }- G/ k" j( V我也觉得中间是引物二聚体 但是我做的其他基因就没有这种情况
作者: gxbzjznn    时间: 2016-1-13 22:31

回复 thinktank 的帖子+ v! b# T1 e% P+ o$ E

2 D- V1 F% ?2 Y9 r5 ]不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢
作者: gxbzjznn    时间: 2016-1-13 22:32

回复 nichifanlema2 的帖子
! `8 h5 w: ^7 M& E8 s* |8 Z" I. O  @8 Z, a8 v: @
Takara
作者: gxbzjznn    时间: 2016-1-13 22:32

回复 king8 的帖子9 o7 |% K  t7 z9 V% E% ]

  L6 g$ D# n% W' A, ^' e$ d. E8 x不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢
作者: gxbzjznn    时间: 2016-1-13 22:34

回复 云飘过的思念 的帖子$ u' c# r' j$ i5 v

4 m! C8 v- x- u, o7 U$ l1 B我们用核酸染料是Gelview
作者: gxbzjznn    时间: 2016-1-13 22:38

回复 nichifanlema2 的帖子
8 c: z7 R9 ?3 ?  d$ d" m9 B, d" b; @7 d1 M) P+ |
我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？
作者: 云飘过的思念    时间: 2016-1-14 11:59

本帖最后由 云飘过的思念 于 2016-1-14 12:00 编辑
9 m. O8 f" x- [* f
- w( ~( O, g: D回复 gxbzjznn 的帖子% E" p1 ~7 w! J

8 c! K) z% a  a$ \" d% e4 z恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿
作者: 云飘过的思念    时间: 2016-1-14 12:07

本帖最后由 云飘过的思念 于 2016-1-14 12:08 编辑
4 m4 a* e* [6 I3 A
gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38 $ k6 M$ S( A7 k$ M- f
回复 nichifanlema2 的帖子
0 R) F+ w" s" z- U9 o
! s% P/ X& i7 S! S我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...
8 Z+ b& R; f, ~4 d* b! V
7 L- z: }) T. J7 B" w& h
我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考, c  h2 a  s6 t" j# H* ?
实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数8 i, p& a6 J* ]
实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W9 Q0 }% J1 ]4 |; B/ u
补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）) M1 x9 l$ d% ^/ l& W5 |
* w  Z! B- W8 S3 S9 y
定量设备为NanoDorp2000
作者: nichifanlema2    时间: 2016-1-14 13:09

回复 gxbzjznn 的帖子3 t0 h/ |* L, N6 P

6 H! f1 ]& {# J* V1 J& n+ u1 _4 B8 @引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。



欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/) Powered by Discuz! X1.5