干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: Car-T操作流程 [打印本页]

作者: lml0716 时间: 2016-2-2 16:41 标题: Car-T操作流程

新版起草人：lml 编号： SOP-001
2016年外周血Car-T细胞培养标准操作流程页数：1/56 y+ H+ q& V8 V3 ~' ]3 q& Q
Car-T细胞培养标准操作流程
1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养7 U8 N+ B. I7 J
3责任人：实验员人、临床相关人员% ~4 Z! X5 @: j& F+ w3 h6 p
4 内容! G. H. u! v' F/ `. g
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管' {7 g# g; I' ^5 i  y
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。1 k, ^% B& S! w% E) k) O& n5 l
4.3环境：* e% Z, c: R1 M# q/ C
4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在  r2 [+ }8 L' ?! r
百级生物安全柜内进行。" ~7 w4 z: X+ B/ O
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间1 J& V# j$ z4 l' P8 \4 g6 Y
不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
4.4操作：7 F/ F$ o, O" U: I5 ~' t" \/ a4 p. m
4.4.1采集接收外周血; l' m3 X/ p$ H6 S
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。9 M( _" G" I7 \/ t" E
新版起草人：lml 编号： SOP-0014 s& w5 u/ F8 _; u! @  J
2016年外周血Car-T细胞培养标准操作流程页数：2/5
, ]9 H. M" [9 {  r8 ]$ u3 z/ h
4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信" G' V3 M8 M+ U  f
息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。" ]2 g9 h! ?- [7 Q# N
4.4.2操作前准备
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安
全柜运行稳定。% m( \2 Z% Z. |  j
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。% f8 H( u# \; Z7 b9 D1 z' Q& s/ i$ E
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。: A( }8 @  H# _& C' M0 r) U
4.4.3  分离单个核细胞（PBMC）： 5 {" w/ O$ L; Z* F: h/ c/ }
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋" [4 T! c. @! w! _+ d- U
内外周血转入50ml离心管中。+ L/ P% d! D' z" V& o- @  T% w
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。5 c/ ~; K0 i# Q! ?" m7 D
4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
4.4.3.4配平离心1200g(2100r/min)离心20min，慢升慢降。
4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处; `' C0 b4 R% ~% s; e
' d3 n3 O0 m& b: E. d
新版起草人：lml 编号： SOP-001
2016年外周血Car-T细胞培养标准操作流程页数：3/5
  H) W! K9 {# o; P- S6 C
弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细
胞悬液体积比应大于1:3，混匀。
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
4.4.4细胞培养：+ x( w5 Z& W6 O  v; Y6 ~5 U9 V  Q
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞+ y: o* D8 ?2 {- C9 c: ?
培养基PH值7.2-7.4。
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中(T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml)。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中(100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25)，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。: b: l' Q6 p# A- |9 D1 i- b
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。$ \1 g9 {( k0 @2 Y, `
新版起草人：lml 编号： SOP-001; W  x" V6 a* _) m# r
2016年外周血Car-T细胞培养标准操作流程页数：4/5

4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2  100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。3 k2 l1 N3 Z7 l2 p9 Q, v
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2  100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。7 J0 A' j0 D! M. Y3 k. U
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。1 R: X4 ^, g$ y- i1 `9 r
4.4.5 Car-T细胞收集：
4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。1 U; _* C. R" v  ^: ~
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。+ }  _( v8 k5 R, Y& `
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。
新版起草人：lml 编号： SOP-0015 x3 O/ r! p+ v4 E4 g$ O, X
2016年外周血Car-T细胞培养标准操作流程页数：5/5( \) `5 W# L0 q( J1 o
" J) u* {3 t. H1 z: [
细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。4.5细胞运输与保存：
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。7 r! t" u5 D7 P# i- Z
4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。3 }- C6 }$ f% q# V
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。8 c9 _4 @% k- @8 u" g
( |! _, [* k6 H! b! r5 D
9 i7 n! L+ u5 S# T0 a& k! o

作者: yooung 时间: 2016-2-2 16:45

谢谢分享！

作者: 我的小宝贝 时间: 2016-2-2 19:03

谢谢分享！

作者: 吕小松 时间: 2016-2-2 21:09

这是car-T么？转染在哪儿？

作者: biluolinyu 时间: 2016-2-3 13:28

回复吕小松的帖子
}: _3 {! h9 z: s! G0 m
在 4.4.4.5 里面写的
次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。

作者: a276038921 时间: 2016-2-3 15:51

感觉不像啊

作者: 苹果树 时间: 2016-2-3 21:34

为什么没有测转染率呢？怎么知道病毒就转进去了呢

作者: swtarron 时间: 2016-2-4 14:04

怎么感觉不像啊

作者: easyess89 时间: 2016-2-9 23:02

我们医院现在做的是DC-CIK，治疗效果个体差异比较大，CAR-T貌似更高级些，它的治疗效果如何？

作者: ET生物人 时间: 2016-2-16 14:59

不用筛选Tcell？？病毒感染一次就可以？感染率是多少？

作者: kelinzjf 时间: 2016-2-19 22:51

作者: 飞翔的烨 时间: 2016-2-20 08:33

回复 easyess89 的帖子

哪个单位？

作者: 包公 时间: 2016-2-22 13:41

谢谢，参考了

作者: 大林 时间: 2016-3-15 09:49

非常详细啊~ 这样帖子多点就好了~

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)