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标题:
胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)
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作者:
风云动
时间:
2016-2-14 14:55
标题:
胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)
一、细胞
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- t0 P3 R) k' q& M
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡
9 S K5 P2 ?2 L3 V
* h/ A- q7 A( M/ Q
1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。
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2 d9 y9 q- x( k1 V3 L5 G6 R
2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。
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; S0 u9 H' X @& Q0 B- o
3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
8 d9 h2 L4 U& C- s u: A
! x" h' |$ ]# g. n0 E; R
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。
& v* H6 p K8 ^0 a1 G, F
! b9 ]' S! m3 w% Y/ `) v
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。
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& v0 x8 G2 w6 n3 N) {1 e1 t
二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
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9 D& D9 L3 R0 K
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
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4 Q$ Q. X' q* M3 b3 p9 N- l
培养基
' r- L: A0 N* g
5 y1 U7 F" W6 a: w0 d0 m, Z
ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。
X/ C# H8 L3 L1 L: J: ^. N
# m" _4 I0 I/ C
贮存液
! x# E+ @0 F6 ^& A
* c/ s+ c9 j; S
DMEM(高糖)
5 G; t3 \: C$ h# d8 L
" `' L' ~3 G9 k7 s: u! `
马血清（HS）
2 N* S: P& N( K8 L
: U. |: I5 K7 P
L-谷氨酰胺（200M）
9 |3 |; H6 x) n1 S
3 X' n/ h6 Y w' H
MEMNEAA（10M）
+ h3 K7 m! Z9 y
8 ~- g6 g- c$ R; \3 N E8 i* t# T/ H. t
HEPES（1M）
% n8 J: {* ~# [4 e( i+ O) z
$ S2 P2 e, o: s: q/ u% U
?-巯基乙醇（55M）
# l6 [3 y# c& P* ~$ @' w9 E
$ s2 Y% e. \5 V5 W6 t+ h
PEST
! O7 L( _ g; f* w( o; r" Y& |
, r2 b2 U: w. t3 k3 P
ESGRO
9 k" h7 F% [: K! |1 Y
9 j- r8 _& [* m5 w; E1 f
复苏细胞
6 U& g& M: C! D3 M2 e" |' B: g
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细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
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步骤
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1．从液氮中取出一管细胞；
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2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
# L* s! C; j& [. y. C* [0 v, S
% _+ Q9 B( o% x- x/ J
3．将细胞转移到一15Fn管中；
6 ^8 r. f1 r* Z8 A0 [! t6 R r) Z: f
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4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
9 h& Q% x( E2 @4 q e8 M% K
5 J- X' V1 S& k- O# P, m
5．离心3分钟；
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' K$ @( v% P: @1 J" _3 |
6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
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w; R# j6 H1 X& g
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；
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8．孵育。
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