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标题: Car-T细胞培养标准操作流程 [打印本页]

作者: lindsay251 时间: 2016-2-16 09:29 标题: Car-T细胞培养标准操作流程

本帖最后由细胞海洋于 2016-2-16 09:55 编辑
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1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养7 L2 ^& U# I3 c" S
3 责任人：实验员人、临床相关人员。3 W+ V: N: ~6 c4 \5 c- s
4 内容
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。6 j. ^9 R# G; v6 b, Z$ r! a7 k
4.3环境：7 M- M9 H( J- j
4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
4.4操作：
4.4.1采集接收外周血8 z, n8 p/ p; x7 y6 E1 r' v+ F
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。% \3 A- V8 u) Q, X- E( L. B
4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
4.4.2操作前准备+ i, V: c2 ~. r7 a1 j" x
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。, R$ R3 M/ z& ^) ?6 ?
4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。( i$ x8 {, Q: f) T3 r4 t
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。
4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。& l! O$ @( Z" j; C1 B9 w9 ~  ^
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
4.4.4细胞培养：& H3 F* ^9 P; z) ?( }) T7 S) m
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。" g, n( X# o; n
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。/ a8 f6 g1 N% _' ]* y% @
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。. S- Q1 U2 z0 w( S/ h5 k5 a. |
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。; \, R8 [) s6 _5 `' Q" g; L7 M
4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。6 {* L. F0 E- e. F& U6 s+ D  ^
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。0 ^0 F' [1 \9 C: ^/ @& I
4.4.5 Car-T细胞收集：
4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。) B. F2 K% V  Y" N6 h" `+ s5 U
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。+ N' n* |7 K5 h
4.5细胞运输与保存：) Z& }0 _# l- s
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。. }8 f# b9 ~+ C/ J  u3 _+ D# I
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。9 w5 b7 g" K$ H5 m% @. M; R# m/ z" ~
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。# a8 w8 U3 K+ n) N

作者: murong 时间: 2016-2-16 13:37

感谢

作者: shunho-cell 时间: 2016-2-17 08:49

请问您是哪个实验室的？

作者: a276038921 时间: 2016-2-17 11:09

你这也没有转染啊

作者: guzhouleng 时间: 2016-2-18 17:32

细胞回输之前不用分选么？

作者: liyan 时间: 2016-2-19 09:21

谢谢

作者: lindsay251 时间: 2016-2-19 15:35

回复 guzhouleng 的帖子
4 b: [/ n/ s; n8 L- k/ J4 t; d
培养期间加CD3/CD28磁珠就是分选啊

作者: lindsay251 时间: 2016-2-19 15:46

回复 a276038921 的帖子1 e' v' p, c4 F( g
2 r! x' h1 z1 I& }$ c$ I
这个操作流程不是我们自己做的，但我想4.4.4.5 中“加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养”这就是转染过程吧

作者: guzhouleng 时间: 2016-2-23 10:23

回复 lindsay251 的帖子6 U5 K! d/ Y" Y) Q: W* |( K
# b) [1 l3 }: l% O6 Q* A7 ?+ y
这个磁珠不是用来刺激T细胞的么？第4.4.4.7步磁力架上只是去除掉和细胞结合的磁珠，而并非用磁珠将某类细胞拉出来，我这么理解应该没错吧？, ]2 y. X3 S+ d: }+ i# ~. C( O
不过分选的时候不是应该是将成功转染了CAR分子的细胞分选出来么？这一步貌似没有看到诶

作者: a276038921 时间: 2016-2-23 15:30

回复 guzhouleng 的帖子: ?$ e' Y/ R6 ^( T/ b0 X3 b! w

用磁珠去除的是CAR-T以外的细胞，留下的才是想要的细胞

作者: lyj-0017 时间: 2016-7-4 13:30

回复 lindsay251 的帖子3 W6 g0 ~" u1 U2 \
9 ^2 G$ b5 z/ U1 @
“4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养”1 ?+ Y3 y( W3 {7 f8 Y, D
S1 w9 T6 Q5 t8 V
这一步骤加入的抗CD3和抗CD28抗体偶联的磁珠，抗体的作用肯定是刺激活化T淋巴细胞。
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但在接下来的步骤4.4.4.7中又要去除磁珠，而磁珠是偶联抗CD3/CD28抗体，这样不就相当于将一部分CD3+的T淋巴细胞也同样去除掉了吗？相当于损失了一部分T细胞克隆的母细胞吧？

作者: tyzbtx 时间: 2016-7-7 09:15

CAR-T怎么检测表达率呢？

作者: 细胞海洋 时间: 2016-7-8 17:16

回复 tyzbtx 的帖子
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作者: win369lzww 时间: 2016-7-15 11:37

感谢分享，学习了

作者: xcb726 时间: 2017-3-29 08:29

非常感谢，非常受用.....

作者: ppzl 时间: 2017-3-31 11:33

不错谢谢

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