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标题: 终止胰酶消化的培养基量的定位 [打印本页]

作者: 1195963542 时间: 2016-2-16 10:15 标题: 终止胰酶消化的培养基量的定位

MSC加入胰酶消化一定时间后，需要进行终止消化，那么终止消化的培养基的量是不是≥胰酶的量即可，可以＜胰酶量么？这个量是根据什么定的

作者: watchen198891 时间: 2016-2-16 13:20

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最好过量一点，另外还要看你胰酶的浓度，终止最终只是防止细胞消化过度，让细胞状态变坏。所以过量一点比较好。

作者: yooung 时间: 2016-2-16 16:17

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这个问题值得好好研究。+ ^* n: s' Z, M O1 b8 r
我认为在确定终止消化的培养基量这问题之前，应考虑另一个问题：培养基能终止胰蛋白酶消化细胞的原理是什么，即培养基为什么能终止胰蛋白酶消化细胞？9 c2 U8 o5 h1 }% |) N
我查阅有关资料，总结出几个可能的原因：
1.胰蛋白酶抑制剂作用：培养基一般含有血清成分，而血清中含有抗胰蛋白酶成分，即胰蛋白酶抑制剂，能抑制胰蛋白酶的酶活性，如抗凝血酶Ⅲ等，终止其继续消化细胞膜上的蛋白。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,而抗凝血酶Ⅲ则是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。
2.竞争性抑制：培养基含有大量蛋白，这些蛋白与细胞表面蛋白一样，作为胰蛋白酶的底物，来和胰蛋白酶来结合，使细胞蛋白和胰蛋白酶结合的机会大大减少，从而起着终止胰蛋白酶消化细胞的作用。- {0 Q9 m2 |- m
3.钙、镁离子的作用：培养基中的钙、镁离子可能影响胰酶的消化能力，导致胰酶消化能力下降。
4.稀释作用：胰蛋白酶消化细胞的能力与其浓度有关，加入的培养基使胰蛋白酶浓度降低，使其消化细胞的能力减小，故能终止消化。
从上述可能的原因来看，终止消化培养基的量应该要比较大，这样终止效果才比较好。查阅有关资料可知，终止消化的培养基的量至少要大于胰酶的量，一般为胰酶量的3~5倍。

作者: daviddow 时间: 2016-2-19 10:18

相同数量的培养基就可以

作者: zhouweixing000 时间: 2016-2-19 11:28

原则上1比1就能终止消化，但是经验告诉我们还是要多加一些，稀释一下细胞浓度，这样贴在平皿上或者培养瓶上的细胞就会少一些，浪费也就少一些

作者: 小猫狸狸 时间: 2016-2-19 13:48

一般来讲培养基与胰酶等量即可，完全可以终止消化。但是实际操作中，可以多加一些培养基，细胞的状态会更好一些，损失也会更少一些。

作者: feifa1314 时间: 2016-2-21 14:17

要注意的是，在养MSC时如果使用的是限定化学成分的培养基，就不能直接来终止胰酶。而是要额外准备胰酶终止液。

作者: jiefengbing 时间: 2016-3-1 10:34

一般来说，1:1的比例就可以了。在操作的过程中，自己摸索一个浓度，以细胞状态不变差为标准

作者: jddakui 时间: 2016-3-1 11:07

一般情况下1:1就可以，因为你马上就要进入后续操作，离心清洗等等除非你样品量特别大，可以考虑增加比例，防止后续操作等待时间过长而消化过度

作者: saliai2016 时间: 2016-3-2 17:17

建议培养基充足的情况下多加一些，由于是在对一些难消化的细胞进行消化后，还会进行吹打，若培养基过少，容易产生气泡，气泡炸裂也会对细胞造成机械损伤。

作者: 野猪 时间: 2016-3-4 10:49

如果终止消化后，离心去掉上清，再培养的话，终止酶解不需要太多培养基，大于酶解液就可以。
在刚培养细胞的时候，因为听说，酶解后终止加入等量培养基不需要离心，直接用完全培养基直接稀释至需要传代的体积然后培养。
自己尝试了一下，结果，过了周末回来，细胞都不见了。。。。。4 Z4 \' |. _ X1 n% U
所以我觉得完全培养基可以削弱胰酶的活力，但终止真算不上，还是尽量加多点比较好。

作者: Diane0321 时间: 2016-3-4 21:47

一般我们都会在1：1的基础上再加一些，这样可以更好的维持细胞的状态

作者: yeshch 时间: 2016-3-11 10:20

为了降低对细胞的损伤，我们经常把胰酶稀释两倍，这样终止时加含血清的medium 1:1终止就好；如果胰酶原液消化的话，建议多加一点培养基终止，尤其是培养基中血清浓度不高时

作者: cellcellcell 时间: 2016-3-11 10:28

本帖最后由 cellcellcell 于 2016-3-11 10:37 编辑

当时我们在培养肿瘤细胞或者正常细胞的时候，用于消化的胰酶与培养基的比例是1:3，即一瓶25cm规格的细胞用1ml的胰酶（0.25%）消化，消化完后用3ml的全培终止消化。9 g# c3 \8 | f Q% l
如果想知道具体的操作，首先要搞清楚为什么要用全培来终止消化？因为全培中含有某种抑制胰酶作用的成分，所以要用全培来消化。而且胰酶消化时，要先将胰酶放在37℃水浴中预热，然后再加入培养瓶中，这样使胰酶的活性最强，消化作用最好。

作者: 田甜 时间: 2016-5-16 17:01

T75为例：1ml0.25%-0.02的胰酶-EDTA，消化观察细胞变圆，消化充分（但细胞还未脱落），弃取胰酶，加4ml血清培养基（可以是新鲜培养基，也可以是之前培养的上清）。一直这么操作，效果不错。

作者: Diane0321 时间: 2016-5-17 19:12

原则上来讲按1：1加培养基，但是很多时候多加一些会更好一点，以确保完全终止消化，对于MSC，我一把都是加等量的培养基终止消化，而且消化时间短一些，因为它很容易就消化下来了，所以一定要把握好终止消化的时间，以免消化过度

作者: veda327 时间: 2016-5-18 10:00

第一：如果是需要进行临床试验的MSC，体系内最好不要混入动物源性的血清，所以准备这个一枚的终止液需要慎重。3 G8 a& u* Z% o! e$ ]* |
第二：不知道大家都是怎么操作的，难道是胰酶消化之后就直接在消化液中添加终止液么？我一般都是加入一定量的胰酶消化液消化一段时间后去除消化液，让残留的消化液继续消化几分钟，见到细胞开始（成片）脱落之后加入生长培养基，这样子就不需要考虑什么终止液的用量了，体系内实际残留的胰酶的量非常少了！

作者: 蚂蚁上树 时间: 2016-5-19 15:24

是血清成分终止了胰酶的作用，所以，个人认为不应该只看终止培养基的体积，而是培养基中的血清的含量，血清浓度大的可以稍加一点即可

作者: 枫之叶影 时间: 2016-7-11 09:57

无血清培养基培养的细胞消化，应该是降低胰酶浓度，从而是胰酶的消化能力减弱或者消失，这样看至少是1:1的终止液终止消化

作者: hitmanc 时间: 2016-7-29 15:26

用之前培养液上清，添加量至少比胰酶多

作者: anning111 时间: 2016-8-5 16:37

实话告诉你吧，真正能中止胰酶消作用的是FBS，而不是基础培养基。9 q- o8 Z9 b/ a0 F1 ~& y6 k) I3 E, P

如果是Tryple,只能采取稀释的方式才能终止消化。

作者: 风倾颜 时间: 2016-8-30 16:11

我们实验室一般情况下是1:1的加，不过我觉得还是多加一点的好，防止过消化

作者: abc2613130 时间: 2016-8-30 16:29

原则上都是等量添加，但是，我们操作的时候就基本上都是两倍量

作者: bubble_w 时间: 2016-8-31 13:49

回复 1195963542 的帖子9 e* ~9 o$ C6 B) W3 E+ U

终止胰酶消化的量是一定要大于胰酶使用的量。有人使用品牌生产的胰酶抑制剂作为终止消化液，我们实验室一般使用培养液作为终止消化液。至于终止消化的液体量要看实验室的经济情况，我们一般采取至少两倍消化液的体积的量去终止消化，这样做的好处是终止消化比较彻底，加入的液体量大对消化为悬浮状态的细胞有保护和缓冲的作用。当然，如果你们实验室经费充足，建议3-4倍胰酶量的培养液终止消化，这样对大量贴壁细胞的彻底消化也是有好处的。

作者: sfnana 时间: 2016-9-2 09:00

一般我们要求是等比例中止消化，但是在实际的操作过程中，我们一般都会多加一些培养液来中止消化，原因如下：, L2 P; j6 ^$ K; ]( t
1.血清可以更充分的与酶结合，彻底中止酶的消化作用。在操作的时候，因为一般都是多瓶操作，所以后面几瓶等待的时间可能会较长，如果按照1:1中止消化，有可能中止不彻底，胰酶继续作用，毕竟胰酶对细胞的伤害比较大，所以可能导致同批次的细胞有的传代后细胞状态好，有的不好。. |% g5 m5 k# O6 y3 h$ s
2.对于贴壁细胞来说需要吹打，如果液体体积太小，吹打过程中容易产生大量的气泡，这些气泡的产生对细胞的伤害也比较大。

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