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标题: 谁能说说到底什么情况治疗用NK细胞，什么情况用CIK治疗？ [打印本页]

作者: lgfffancy 时间: 2016-2-26 09:14 标题: 谁能说说到底什么情况治疗用NK细胞，什么情况用CIK治疗？

目前这两种治疗很热，但是好像这两种治疗没啥区别。, m# F% A6 P' C( Y1 H& q9 b9 {
那么对于一个病人而言，你作为医生或学者，你根据什么来判断其实用NK cell therapy还是CIK cell therapy呢？& t# c) e2 A& s' ? U0 d* `! Z3 ]
我认为这个问题需要大家积极讨论，而且我认为目前在采取这两种治疗方式的绝大多数人都没把NK与CIKF分别具体用于哪类人群搞清楚。# i% j+ ]) _5 a. S3 \: ?
值得大家积极发表意见，更别用说一个疗程，输注几次细胞，每次输注细胞的量，以及每次时间间隔等问题了，Let's discuss, come on!

作者: 奇幻雪蓝 时间: 2016-2-26 09:44

等下次开细胞治疗大会了，把这个问题提给专家，看看会不会他们问晕！！

作者: lgfffancy 时间: 2016-2-26 10:00

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一起讨论吧

作者: saliai2016 时间: 2016-2-26 14:08

NK细胞用于平时日常保健，提高自身免疫力，CIK细胞用于癌症患者，一般癌症患者用DC-CIK。

作者: lgfffancy 时间: 2016-2-26 15:24

回复 saliai2016 的帖子4 ` M. E/ D z- E0 E" ~, ` r

那对于NK和CIK的疗程是大概什么样的啊？每次细胞量，一个疗程输几次，每次间隔多久啊？' w" d" Q1 _( n0 L/ b- R+ p
一年一般做几个疗程啊？
谢谢，确实这个不太清楚

作者: cneagle66 时间: 2016-2-27 09:36

上海、山东有免疫细胞行业自律规范，上面有基本要求和更高要求，对于每次治疗的细胞数目都写有明确的数量，细胞的质量控制也有要求，可以搜一下站内消息。不过，免疫细胞治疗的细胞量、疗程、间隔，现在谁都说不清，因为免疫和肿瘤的关系之间，还有很多东西没搞清，个体也有差异，各家所用的技术也不一样。我觉得金标准是肿瘤被抑制（带瘤生存）或者彻底消除，但是现在除了CAR-T，没有哪种细胞敢说有这样的效果。

作者: lgfffancy 时间: 2016-2-27 10:09

回复 cneagle66 的帖子

你好，我没查到这个自律规范，你能说说这个免疫细胞的自律规范的全名吗，没在站内搜到，想拜读一下这个规范

作者: 细胞海洋 时间: 2016-2-27 21:09

本帖最后由细胞海洋于 2016-2-27 21:09 编辑 2 a9 ?$ D# s/ w2 c
! k7 w l& U0 e1 H: G
回复 lgfffancy 的帖子# B) B7 a2 B+ z& @

干细胞之家微信公众号上面有全文搜索：stemcell8

作者: xiaoxiaodeji 时间: 2016-3-9 11:06

现在对于是使用NK、CIK还是DC–CIK没有明确的答案和规定，但是各种细胞是有质控要求的，回输前的数量、安全性、表型都有要求的，但是还是缺乏权威性的指南

作者: 飞翔的烨 时间: 2016-3-9 19:43

本帖最后由飞翔的烨于 2016-3-9 19:50 编辑

这个问题是我这几天一直思考的，我总结了几点，不知对否，请大家点评：! p# F! h. t  t8 _9 w! i
1：首先是纯度问题，约定俗成的：NK至少要大于50%，而CIK一般只能达到10%-30%，所以就质上来说，NK完胜& b; B6 k, d3 [/ L; L4 P+ T/ K
2：NK是人体正常存在的细胞，而CIK是异质细胞群，就进化论来说，机体已经习惯NK的存在，因此，可能有的副反应应该是NK小$ ]6 f# h" |- x
3：NK细胞使用异体健康细胞和半相合细胞不仅不会有排斥，而且比自体的效果好，这个是很多文献、专家、大咖论证过的，CIK做异体细胞不知道有没有排斥反应，理论上应该有。所以对老年人、免疫功能弱的、身体虚弱的准备用健康人淋巴细胞培养的，还是NK优于CIK1 E2 X0 @# S. }  o) z+ p8 C" J( c& ?
4：高浓度的NK可以用来美容，原理大概是NK在体内还能清除衰老的和凋亡的细胞，净化外环境，所以使人精力充沛，气色怡人，使人年轻。这个是有本行业大牛论证的，而且一直给其夫人使用。健身美容两不误，NK完胜4 N4 A  h8 X% X' V
5：因为NK在人体脾、淋巴结等淋巴组织里都存在，因此NK对经淋巴道转移的病灶的疗效应该优于CIK。
其实，NK与CIK的培养体系里，两种细胞都存在，只是我们需要的目的细胞侧重点不同而已。$ N* M2 A: y% \6 q# f! m8 q5 i
希望抛砖引玉，百家争鸣。谢谢

作者: 飞翔的烨 时间: 2016-3-9 19:49

NK与CIK都是非特异性的免疫，DC-CIK如果是空载，我觉得意义不大，而DC如果负载特异性肿瘤抗原，那么就是半特异性的免疫治疗了，效果应该优于单纯的NK与CIK.但是，目前市场上有的大部分我认为不能称为肿瘤特异性抗原，只能称为肿瘤相关性抗原，因此，疗效就要打个折扣了。

作者: lgfffancy 时间: 2016-3-10 09:24

回复飞翔的烨的帖子# u0 |& o2 d; `4 j, p" s' B* x" e% R

赞同。现在就是很难搞懂，对于CIK 和NK分别针对什么样的病人使用这一方面，还是一个很大的问题

作者: cellcellcell 时间: 2016-3-10 17:57

就目前了解到的情况，NK和CIK均能用于肿瘤辅助治疗，但NK细胞一般在肿瘤早期治疗有效，CIK可以用于肿瘤发展的任一阶段。

作者: 536536 时间: 2016-3-11 13:00

用于肿瘤, NK的效果非常有限，NK这个第一道防线被击溃，癌组织才逐步形成。用已经无能为力的NK再来攻击癌细胞，有啥意义呢。
- g5 u$ N2 L$ e$ l: P! f2 Q5 ~
CIK细胞，实质为多种T细胞亚群的综合细胞群，当然也含有少量NK。" i% @. K& z; [- l4 z1 T3 t
) D) S: Q0 E$ ^3 c# m4 ~4 v
国内一些教授主观地把CD3CD56，认为是CIK表型。本身就是错误的。 CD3CD8的比例其实比CD3CD56的比例更为重要。

作者: lgfffancy 时间: 2016-3-11 15:28

回复 536536 的帖子
2 \+ l, p, h3 }! {9 P9 Z( a
对我也一直在思考NK细胞对于肿瘤病人的意义。
但是目前用于病人的辅助治疗的话，NK和CIK都在用，而且用得很混淆。
我想知道什么情况用NK,什么情况用CIK?
以及每次细胞的量和间隔时间

作者: 536536 时间: 2016-3-11 16:44

回复 lgfffancy 的帖子# }: a& c) T" q0 y1 Q# c

在医学免疫学教材里面，只提到了NK可能对淋巴瘤，白血病有一定的疗效，对实体瘤效果很差。

目前国内有某些公司用滋养细胞（比如K562，名曰已灭活）的技术方案，来提高NK的纯度，并且用于肿瘤病人，简直就是把人当成动物来整。

作者: 536536 时间: 2016-3-11 16:48

NK的杀伤活性，肯定是低于T细胞的。 NK属于基础防线。觉得NK拿来做保健，还是可行的。9 @4 i! x7 z7 l$ u
现在都是搞资本炒作，深圳每家生物治疗公司都说自己在研究CAR-T，都是在炒作概念，套研究经费和那些矿老板的傻钱

。

作者: Ivan0108 时间: 2016-3-12 10:07

1、人体如果有肿瘤组织产生，说明自身的免疫系统已无法有效识别肿瘤细胞。而NK细胞本身纯在与人体，所以说对于肿瘤病人理论上不适宜使用NK细胞。最多起到一个提升免疫力的作用，对于肿瘤细胞杀伤效果非常有限。, f3 d, J& Y5 F/ R {- W2 C/ \7 G. g
2、CIK细胞虽说是体外细胞因子诱导的一群异质细胞，但其实大部分细胞还是CD3+CD8+细胞，CD3+CD56+细胞一般保持在10%-40吧，临床治疗肿瘤组织杀伤力还是有限的。但是效果好的，基本也可以保持肿瘤组织维持不变，不继续恶化，而且放化疗后的病人免疫力非常低下，如果有CIK细胞回输不但提高免疫力，有效改善放化疗后遗症，对于患者生活质量会有个非常大的提高。

作者: lgfffancy 时间: 2016-3-13 10:55

回复 Ivan0108 的帖子
( M; W) c( g6 X( ~- ] y
恩明白，现在就觉得这一块做得很乱，没有一个具体的治疗方案或者治疗依据什么的。

作者: lgfffancy 时间: 2016-3-13 10:56

回复 536536 的帖子

对我也觉得NK可以做保健。但是目前国内NK CIK 做得很乱，对于一个病人真的没有具体的依据是用NK 还是CIK了，无从下手的感觉。

作者: 拉二胡的拉尔夫 时间: 2016-3-14 13:54

1.单纯比较CIK与NK的话，肯定是NK细胞完胜，因为效应细胞都是CD56+，应为都是非特异性的体液免疫，那么效应细胞的浓度就决定了一切，我自己的实验经验来看yibanNK细胞CD56阳性率基本都能达到60%以上，而CIK细胞CD56阳性率最多也就到30%，更多的是未激活的T细胞。' \: J3 y/ }7 r3 D4 C- M
2.如果比较DC-CIK与NK的话就另当别论了，在没有抗原刺激的时候DC-CIK与CIK几乎没有区别，最多也就是数量不同，但是当有抗原刺激的时候，细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞的活性就大幅度提高了，就是特异性淋巴免疫反应，其谱系是MHC识别和非MHC依赖的，比NK和CIK杀伤效率提高很多。. I. ?0 y; z- q
3.DC-CIK培养成本和扩增倍数优于NK细胞。

作者: lgfffancy 时间: 2016-3-15 09:15

回复拉二胡的拉尔夫的帖子

分析得很有道理，谢谢。那现在对于NK CIK 以及DC-CIK而言，我们一般用的剂量是多少，每隔多少天回输一次呢，大概需要输几次？请假一下

作者: 大林 时间: 2016-3-15 09:29

回复飞翔的烨的帖子

非常感谢，学习了~ 我就是打算培养NK

作者: 拉二胡的拉尔夫 时间: 2016-3-15 11:17

回复 lgfffancy 的帖子

现在基本上都是14天为一个周期，最多可以培养到21天。按照我的经验来说，一般一个疗程回输三次，每次细胞不低于10*9,最多不超过10*11。对于肿瘤病人，前期间隔较小，当病情稳定后，逐步降低频率：对于正常人来说一年不建议超过两次。以上是我个人经验，希望能帮到你

作者: 大林 时间: 2016-3-15 11:42

回复拉二胡的拉尔夫的帖子% k' U) g4 b) e8 e9 u

很详细了，谢谢~

作者: cellcellcell 时间: 2016-3-15 14:58

我所了解到的情况是，针对肿瘤，目前国际上已经很少使用CIK以至DC-CIK了，现在主要的发展方向是CAR-T或者taNK
目前所使用的治疗方案是，针对癌症术后预防复发及健康人群预防癌症，大约是每三个月左右进行一次回输，但回输量等情况不明
此外，就NK细胞而言，临床上针对肝癌及胰腺癌使用或可取得更好疗效4 k8 T7 {4 \2 m
希望能看到大家更多的讨论增进对这一问题的理解。谢谢

作者: lgfffancy 时间: 2016-3-16 09:20

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6 R- ^5 K. Y I2 C7 }* T/ Q
恩我明白你的意思，但是CIK DC-CIK在国内还是很普遍而且一直都在使用，这一方面的信息我们目前还不是很明确，它的适应症，它的用量，疗程这些；
对于CART确实很热，是一个发展的趋势，我个人认为CIK DC-CIK NK 会和CART并存，对于不同的情况选择不同细胞治疗方式。) |, p2 P3 E4 K( q" k# C
而且大家也应该知道其实免疫细胞治疗在国内是比国际上用得更火的，我总结很多片文献报道都是国内做的研究。

作者: lgfffancy 时间: 2016-3-16 09:22

回复拉二胡的拉尔夫的帖子

太感谢你了

，有种交朋友的冲动

$ S4 s/ P4 F) N* m0 v6 K
我赞成你的说法，目前比较困惑我一点的是，什么情况用NK 什么情况用CIK,特别是对于亚健康病人而言，希望一起讨论一下吧。

作者: 拉二胡的拉尔夫 时间: 2016-3-16 12:00

回复 lgfffancy 的帖子
* v' f5 q) Y5 ~, p) F
能获得肿瘤组织，或者抗原的建议使用DC-CIK，没有的话NK最好，不建议单独使用CIK，增殖没有DC-CIK快

作者: easternliu 时间: 2016-3-16 12:28

肿瘤的难治性在于肿瘤的异质性，不同免疫细胞类型，作用的机制是不一样的。( H. l- Z, z: v. ]
CIK作为一群异质细胞，有CD4+的，有CD8+的，有CD56阳性的。每种标志都代表不同的功能，但是体外用CD3激活T细胞是非特异性激活的，而特异性杀瘤必须是那一种或者那几种TCR的T细胞，所以上面有位同学提到双阳，双阳作为cik主要效应细胞，这种看法本身没有问题。
NK细胞作为先天性免疫的核心组成，天生自带颗粒，发挥效应快，发挥ADCC功能强，是非常好的一种效应细胞，所以taNK现在能那么火。楼上也有同学提到，有用因子扩增NK的，有用feeder扩增NK的。每种技术手段各有优势，都是经过临床试验证明安全有效的。feeder技术也是细胞免疫里很有前景的技术，现在cart相关feeder应用也很多。所以那位同学的观点我表示不赞同，欢迎不服来辩。
所以联合抗体靶向药要ADCC了首选NK;患者采血困难，首选半相合NK;有肿瘤组织首选DC-CIK
其他情况可以考虑交替做，因为肿瘤的异质性，有条件的可以做肿瘤组织MHC-I类分子表达情况来首选哪种治疗方案。MHC-I低或不表达，首选NK，高表达首选T细胞。

作者: lgfffancy 时间: 2016-3-16 14:13

回复拉二胡的拉尔夫的帖子5 J9 @& y6 A2 ]: x: @7 n6 ^
' B" C% J2 B7 E: i! e0 B
got it. 我的理解会觉得NK的作用更广，以及便于培养和应用。

作者: 我是传奇 时间: 2016-3-17 15:29

NK更多适用于上皮样细胞癌，CIK适用于免疫原性较强的肿瘤。但是二者目前在临床上针对各种肿瘤的实际应答效果并不高，所以很难给出具体适用的结论。

作者: 我是传奇 时间: 2016-3-17 15:38

回复飞翔的烨的帖子
3 C& L* Y) x( F1 V$ X/ l
1.NK做到50%太少，另外你也需要结合细胞数量和临床应答再评判吧" y/ _: I% n- @- N; `9 B
2.副作用是看二者对于靶细胞的杀伤作用来看，如果是脱颗粒杀伤必然都会引起副作用，如果是已发靶细胞有序凋亡则副作用会很小，二者对肿瘤细胞的杀伤途径基本相同，因此更不能从二者的先天存在来判定副作用高低。( U: Q9 w0 A$ q0 M
3.做异体治疗应根据白细胞表面抗原配型来决定临床施治，有效果好的，但效果不好的大有人在。9 ]# w4 _/ `* ]6 k6 u
4.把免疫用于美容方面实在可笑，清除机体死细胞或者是不年轻的细胞不代表有新的好的细胞补充或替代掉原来衰老的细胞，理论根源就有很大瑕疵！( h- _9 N# }( Z3 [ @/ y4 a* v
5.存在于免疫组织和各种淋巴结的CIK要远远多于NK，CIK兼具特异性和非特异性杀伤两大优势功能，为什么NK就会比CIK强？匪夷所思？

作者: xingyanchao 时间: 2016-3-18 18:15

回复 lgfffancy 的帖子# i+ n: _7 @1 K  b$ d

山东省细胞免疫抗肿瘤治疗业内自律性规范2 P6 R: W2 V. v2 g
--山东省生物医学工程学会干细胞与再生医学专业委员会免疫细胞治疗学组2015年4月23日通过
为了保证细胞免疫抗肿瘤治疗的健康、有序的发展，保证医疗安全，为肿瘤病人提供一种安全、有效的治疗方法，根据国家药品监督管理局颁布的《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》和《药品GMP认证检查评定标准》的有关规定，并考虑到多数从事细胞治疗单位现有的条件，按照循序渐进的原则，使我省细胞免疫抗肿瘤治疗领域各项工作逐步走向规范，特制定《山东省细胞免疫抗肿瘤治疗业内自律性规范》，简称《规范》。" u/ ~* w! \4 ^; ~- {
一、适用范围7 P4 E& h9 T! X( Y1 i; W! G/ r) s! |- T8 }; M% o3 _) t
本《规范》是山东省细胞免疫抗肿瘤治疗领域业内自律性文件，适用于山东省从事细胞免疫抗肿瘤治疗、并且承认本规范的医疗机构和生物技术企业。细胞免疫抗肿瘤治疗是指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的与免疫有关的体细胞，经体外操作后回输（或植入）人体的抗肿瘤治疗方法，包括树突状细胞（DC）、抗原致敏的树突状细胞（APDC）、淋巴因子激活的杀伤细胞（CIK、DCIK、LAK、CD3AK、TAK）、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、体外致敏的杀伤细胞（IVS、TCL）等，其他未包括的细胞免疫抗肿瘤治疗参照执行。
   本规范设定两个要求：基本要求和更高要求。基本要求是指我们目前必须具备条件，更高要求是指今后需要不断改进要达到的最终条件。* R* M1 S0 ^6 C% Q2 H
二、人员配备要求/ F) E- A; t2 H; p* K3 O7 E
1、临床人员要求2 t. [! j" k7 x; m
①细胞免疫治疗临床科主任（负责人）要求：)
基本要求：从事细胞免疫抗肿瘤治疗临床主要负责人须具备副高或以上职称，工作责任心强，具备2年以上从事细胞免疫抗肿瘤治疗的临床工作经验、具备较系统的临床免疫学知识，具有处理细胞免疫治疗过程中可能出现的各种不良反应的能力和相应的细胞免疫抗肿瘤治疗知识，能指导下级医师从事免疫细胞治疗工作；细胞免疫治疗临床负责人担负着培训其他参与此项目的临床医师的职责，并及时与实验室负责人协商，协调病人的治疗方案。
更高要求：在具备基本要求的基础上，经过较系统的免疫细胞治疗培训，具备系统的临床免疫学知识，掌握一定的基础免疫学知识，了解实验室细胞制备流程和方法，掌握细胞免疫抗肿瘤治疗与其他疗法联合治疗方案的制定原则，具备临床科研能力。0 ], t1 b2 }, j7 B) T$ S7 t
②细胞免疫治疗临床医师要求：
基本要求：从事此项目临床治疗的医师必须具备本科或本科以上学历，须具有基本的免疫治疗知识，经过各单位组织的基本培训，掌握免疫治疗过程中不良反应的处理方法和急救方法。
更高要求：在具备基本要求的基础上，临床免疫治疗的医师经过系统专业培训，具备较为系统的临床免疫学知识，并能解释免疫治疗中出现的临床现象。5 y" R) ]8 V; v" u% W# A+ X6 \) ^/ ^- p
2、实验室人员要求
①实验室技术人员要求：
基本要求：具备大学（专）本科或以上学历，具有医学或生物学实验室学习或工作经历，具备一定的基础免疫学知识，经免疫细胞培养培训1个月以上，能识别培养细胞中是否存在微生物污染，会观察细胞生长状态。能正确履行其职责的实验室技术人员。
更高要求：具备医学检验系大学（专）本科学历，或具备细胞培养1年以上学习经历的研究生学历，再经3个月以上免疫细胞制备培训或实习，或具有不少于50例实验性免疫细胞制备经验，方可独立操作。
②实验室主任（负责人）要求：7 n. t; l4 |, e3 G
基本要求：具备副高级或以上职称、具备较系统的基础免疫学知识，并具有2年以上从事细胞免疫抗肿瘤治疗的实验室工作经验，能够指导实验室技术人员工作，具备解决在免疫细胞培养过程中出现的复杂问题，对本规范的实施、实验室安全和制备的免疫细胞的质量负责。承担与临床科室沟通的职责。
更高要求：在基本要求的基础上，具备系统的基础免疫学知识和临床免疫学知识，了解细胞治疗的临床流程，具备基本的基础科研能力，有一定的临床科研知识。具备相关疾病的基本的临床知识。能及时掌握国内外最新的细胞免疫治疗的最新动态。9 R9 w2 Z* |2 q- e
③其他人员要求：
基本要求：从事质量检验的工作人员以及其他需要进入洁净实验室（GMP实验室）的工作人员（包括维修、辅助人员）应在实验室技术人员的指导下，按照进入洁净实验室的流程进入实验室，应具备一定的微生物学基础和洁净作业等方面的知识。
更高要求：在基本要求的基础上，经过一定的洁净实验室工作培训，掌握微生物学知识，培训有记录。
④单位职责：
各单位应建有对各级员工进行本规范和专业技术、岗位操作知识、安全知识等方面的培训制度、培训计划和培训档案，并按照有关规定定期检查，有检查记录。& m! C% \2 e" V( ~
三、材料和设备配备要求  / o& }3 w6 J5 t. h
1.试剂和耗材准入! / w' k( M; s. ?& V, ]6 ~
基本要求：用于临床治疗的细胞悬液制备所需试剂和器械均必须经食品药品监督管理部门审批，具有临床应用的许可证，即注射到病人体内的配制细胞悬液所用液体和添加剂必须使用国药准字号药品，接触细胞悬液的包装材料必须具备医疗设备注册证。一次性耗材禁止重复使用。用于细胞分离、纯化和培养的试剂和耗材以及各种添加剂，均应该符合药品生产企业使用的试剂和耗材的质量标准，每批耗材和试剂均需要有出产厂家的质量检测报告，报告需长期保存。所使用的试剂和耗材以及它们的质检报告均要建立登记制度，保证材料来源的可追溯性。
更高要求：在基本要求的前提下，所有的试剂和耗材均有食品药品监督管理部门颁发的注册证书。+ h# W8 A- l/ F3 n
2.耗材和试剂存放
基本要求：耗材应按品种、规格、批号分别存放，库房干燥、洁净，物品名称标签和进货日期标识清楚，库房存放的物品必须有外包装，洁净实验室存放的物品不得带有外包装，可以有内包装。对培养液和试剂等对温度、湿度或其他条件有特殊要求的试剂和材料应按规定条件贮存。库房存储的物品出入记录清楚，定期盘点。8 z; I& x' y& ?2 C
更高要求：库房要求恒温、自动除湿、有空气净化系统。 7 v7 U; k- [! _" d; i
3.试剂和耗材使用：
基本要求：培养基、培养基添加成分和能接触到培养液的用品必须符合国家药品监督管理局2003年3月20日颁布的《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》标准。可以使用异种血清，推荐使用病人自体血清或血浆。更高要求：商业来源的培养基，应由厂商提供全部培养基成分资料和质量检测报告。采用无血清培养液、可添加病人自体血清或自体血浆，尽量避免使用内酰胺类抗生素。
4、设备配备要求  k& W0 E' ^& n6 M$ X$ e
基本要求：各种细胞制备设备均安放在符合GMP标准的洁净实验室内，主要包括：CO2培养箱、超净工作台、大容量水平离心机、倒置显微镜、加样枪等以及配套设备。检测设备可按临床实验室环境安放，检测设备包括：流式细胞仪。储存设备：细胞储存用超低温冰箱（-80℃），试剂和培养液储存冰箱等。如果较远距离运输（运输时间半小时以上），需要用保温箱（4-15℃）。储存设备应安放于较为洁净的环境中，检测设备应有独立的房间。
更高要求：除了满足基本要求外，细胞制备设备中CO2培养箱，推荐使用具备自动消毒、带有空气过滤功能的培养箱，操作台推荐使用生物安全柜，离心机推荐使用无碳刷、大容量恒温水平离心机，倒置显微镜应带有图像采集系统。检测设备流式细胞仪外，可配备ELI-SPOT检测设备，可根据需要配备部分用于科研设备。储存设备中推荐使用液氮箱，超低温冰箱（-80℃）和试剂和培养液储存冰箱应带有温度自动记录系统，并且配有备用冰箱。细胞运输用保温箱（4-15℃）推荐使用车载冰箱。细胞冻存降温应配备程控降温仪。如果使用组织或细胞制备肿瘤抗原应配备非接触式细胞超声破碎仪。根据需要可配备纯水系统。' P) p) i1 v3 a, L, p& T0 d0 w& o! ~
四、细胞制备环境要求// G% A1 c4 o, F. F
1、细胞采集要求
基本要求：细胞采集应在细胞采集室或治疗室中进行，采集环境需要按照治疗室的规定按期消毒，并进行无菌检测。采集的细胞量要达到能制备出临床所需细胞数量的要求，以DC细胞为主的治疗必须使用血细胞分离机。病人的体质能耐受细胞采集全过程。采集室具备抢救车和简易急救设备。有左心衰症状的病人慎用血细胞分离机。! C! Z' R: R1 R! E
更高要求：如果病人身体状况允许，应使用血细胞分离机采集病人外周血中单个核细胞。采集数量：单个核细胞数不低于1×109,单核细胞数不低于2×108。如果病人经多次化疗或放疗，应适当增加细胞采集数量。. w" m% B, m  t, x+ Y+ Z+ O
2.细胞制备环境要求：
基本要求：采集的细胞进一步处理需要在达到国家GMP标准的洁净实验室中进行，设备和物品摆放、储存必须符合国家GMP的规定。洁净实验室内需配备百级净化超净工作台或生物安全柜，细胞培养的各种暴露性操作应在超净工作台或生物安全柜中操作。提倡一个病人的样本两人独立操作。操作间设置简单，无死角。人和物的通道分离。所有使用的物品均不能产生粉尘和纤维脱落，洁净实验室墙壁无粉尘。进入洁净实验室的物品尽可能保持无菌。洁净实验室定期消毒，空气过滤器定期更换，并进行空气微生物培养，有记录。细胞培养箱应放置在万级或万级以上的净化级别环境中。
更高要求：GMP实验室废弃物品通过专用通道，经消毒后离开洁净实验室。人员进入和离开通道分离。每两周检测一次空气微生物。每半年检测一次实验室净化级别，要保持实验室洁净度不低于万级，有记录。实验室有摄像监控。% S+ U6 |: @( @& p* ^! `
3. 洁净实验室衣物穿戴要求: 0 i' q; F# [' T, }7 Z' B3 M
基本要求：洁净实验室使用的无菌服制作材料要求耐高温、无脱落纤维或粉尘、不产生静电。将这种材料制成连体衣，包含帽子、上衣、裤子和袜子4部分为一体。衣服每周高温消毒一次。进入洁净实验室衣物穿戴程序依次为：换鞋、消毒手和前臂、戴一次性口罩和帽子、穿无菌猴服、再次换鞋、戴无粉尘无菌手套，进入实验室。头发需全部包进帽子里，不得外露。所用拖鞋每1—2周消毒液浸泡消毒一次。
更高要求：要求进出实验室前先洗澡，换实验室内衣，然后，再按照上述流程进入实验室。无菌猴服使用完毕后放入臭氧消毒柜（或其他消毒柜）中消毒，备下次使用。9 {7 m1 D# K" q6 @, Q. x
4.具有感染性样本来源的免疫细胞制备
基本要求：需使用单独的净化区域。若无单独的净化区域，需操作完毕后，彻底消毒，然后再进行其他病人治疗。7 M* ]0 D1 m  {7 ^+ G, a# z: e: |
更高要求：感染样本处理需要有独立的洁净实验室，独立的空气净化系统，专用生物安全柜，生物安全柜气体外排，不进入循环。)
5.洁净实验室检测：) E* V7 V, B1 p: w3 x# }2 W
基本要求：每半个月应监测洁净实验室、操作台和培养箱的微生物数，怀疑有污染随时检测，彻底清除污染后必须检测合格后方能使用。
更高要求：各实验室之间、不同洁净度的区域之间有空气压差检测装置，并有记录。
6.实验室微生物检测方法：
直径10cm的培养皿暴露在操作台内1小时，不应有微生物存在；暴露在细胞培养箱中和洁净实验室内3小时，微生物数不能大于1个菌落，不能有致病菌和霉菌存在。每次检测要有记录。/ W/ h7 a+ D4 }6 P2 n) A
五、治疗所用细胞来源4 i2 x- l0 ^, B! Q( B; @
1.如果条件允许，尽可能采用病人自体细胞进行免疫治疗。不得采用异种细胞。
2.如果采用同种异体细胞，则需要说明供体的年龄、性别，供体必须符合国家对献血员的要求，并提供测试的方法及符合条件的依据。供体必须经过检验证明HBV抗原、抗HCV、抗HIV-1/2、梅毒抗体、细菌、霉菌均为阴性，必要时需说明供体的既往病史、家族史等临床资料。还必须对供体做HLA-I类和II类分型检查，并证明与受体（病人）相匹配，同时提供检测方法和依据。应注明供者的来源并加以标记。) E: m! E" H5 H+ v
六、细胞制备的技术指标和质量控制
1.实验室质控负责人要求：
基本要求：实验室质量负责人应负责细胞制备全过程的质量管理和检验，能独立履行其职责。负责对制备的细胞样本进行质量（如细胞标志物、存活率、杀伤试验等）、数量和微生物学检验（如细菌、真菌、支原体和内毒素检验），并按试验原始数据如实出具检验报告。推荐采用第三方检测。
更高要求：对不同时期的质控结果提供客观的分析报告，并提出改进意见和建议。+ y! y7 T8 Q& N9 q* v
2.细胞培养方法要求：
基本要求：建议1份样本一分为二，两人用各自的试剂独立操作。DC等抗原递呈细胞制备须使用自体血清或无血清培养液，不能使用异种血清（如牛血清等），可使用少量同种异体血清（如人血清、脐血清等）。DC一般要采用自体细胞制备，尽可能避免使用异体细胞制备DC。
CIK、NK等MHC非限制性杀伤细胞培养，推荐使用自体来源细胞制备，培养液可添加异种血清、同种异体血清和自体血清，推荐使用无血清培养液或添加自体血清的培养液。如果使用同种异体细胞制备，则每批应注明细胞来源并加以标记、做好配型、注明供者的详细信息。* O. _+ f! l: R6 V# e
CTL、TIL等MHC限制性杀伤细胞培养，推荐使用自体来源细胞制备，也可采用同种异体细胞制备（CTL），培养液可添加同种异体血清和自体血清，推荐使用无血清培养液或添加自体血清的培养液，在抗原递呈细胞存在的前提下避免使用异种血清。如果使用同种异体细胞制备，则每批应注明细胞来源并加以标记、做好配型、注明供者的详细信息。
更高要求：在满足基本要求的基础上，DC等抗原递呈细胞培养末期，要监测不成熟细胞比例，可采用一切可行的方法，减少不成熟DC的比例。
CIK、NK等MHC非限制性杀伤细胞培养末期，监测Treg细胞比例，鼓励探索提高细胞毒性的培养方法，可采用可行安全的方法减少Treg的比例。
CTL、TIL等MHC限制性杀伤细胞培养，推荐使用TIL替代CTL治疗，CTL培养推荐使用特异性细胞毒性T细胞经纯化后的培养方法。5 g" R/ |, p, r1 F$ o: _) H
3.回输免疫细胞质量标准：( C+ \2 G! }2 r8 s+ R
基本要求：所有临床使用细胞微生物检测指标均为阴性；存活率不低于80%（台盼蓝拒染率）。DC质量标准：CD11c+CD86+双阳性细胞不低于70%，CD11c+CD83+不低于50%，每个疗程有效DC细胞不应小于50×106。
CIK、NK质量标准：CIK细胞CD3+CD8+双阳性细胞和CD3+CD56+阳性细胞总和不小于60%，NK细胞CD3-CD56+细胞比例不低于50%，每个疗程CIK、NK细胞总数不小于50×108。
CTL、TIL质量标准：CD3+CD8+细胞不小于70%，每个疗程治疗细胞总数不低于50×108
更高要求：增加体外检测制备的免疫细胞应具备的生物学功能和生物学效应，比如免疫细胞具有的某种生物学功能，分泌某种产物的能力，表达某种标志的水平等。细胞存活率不低于95%（台盼蓝拒染率）；DC质量标准：CD11c+CD86+双阳性细胞不低于90%,CD11c+CD83+不低于80%，每个疗程有效DC细胞不应小于100×106，检测其递呈的肿瘤特异性抗原在DC细胞膜上的表达率；
CIK、NK质量标准：CIK细胞CD3+CD8+双阳性细胞和CD3+CD56+阳性细胞总和不小于80%，NK细胞CD3-CD56+细胞比例不低于50%，每个疗程CIK、NK细胞总数不小于100×108，CIK和NK细胞检测对靶细胞的杀伤率（可采用恶性黑色素瘤细胞株为靶细胞），同时检测CD4+CD25+FOXP3+阳性细胞比例（Treg），其比例要小于5%；
CTL、TIL质量标准：CD3+CD8+细胞不小于90%，每个疗程治疗细胞总数不低于100×108。检测细胞在特异性肿瘤抗原刺激下，分泌IFN-r的细胞的比例。6 U2 c" u. j) B' E% ~+ \+ u9 k7 @
4.细胞制备记录要求
基本要求：各种免疫细胞制备过程均有详细记录，包括细胞采集数量，获得单核细胞数量、制备方法、使用的培养液和添加剂的数量、批号等相关信息。自体免疫细胞制备及鉴定过程的原始记录和检测报告，并永久保存备查。其他相关操作也要有详细的操作记录。" U0 g0 s6 V- D; I# S
5、标记要求：
所有物品使用或启封后都要有标记，保存的物品、分装试剂、细胞、样本也同样要有标记。标记内容包括：物品种类、名称、日期、添加的因子名称及数量和操作人等内容。标记内容清楚、不易脱落。发送的细胞要注明病人姓名、性别、年龄、科别、住院号、细胞种类、细胞数量、制备时间和操作者等相关信息。  C. J" O6 [, }
七. 细胞保存与运输& b3 b9 R% N- M0 E8 y% W
1、细胞保存与冻存细胞复苏：细胞如果在制备结束后2小时内完成细胞输注放置室温保存即可；如果需要放置2—6小时，则细胞必须保存在4-15℃环境中（冰箱或保温箱）；如果需要长期保存，细胞需要按照一定的浓度加入细胞冻存液，逐渐降温至适宜的温度（-20℃— -80℃）。如果保存6个月以内，可放置于-80℃超低温冰箱中保存。如果需要保存时间超过6个月，则必须在液氮中保存。液氮中细胞保存时间可达到20年。细胞冻存降温推荐采用程控降温仪，也可采用冻存盒和其他可行的降温方法。细胞复苏则需快速升温的方法，推荐使用恒温循环水浴箱，也可使用其他方法复苏细胞。要尽可能避免在细胞解冻的熔点温度时间过长。鼓励对细胞放置6—24小时内添加细胞营养添加剂的研究和探索。% z6 s* o. x( ]. w9 g
2、细胞运输：
细胞从实验室送至病房途中，细胞制剂不能露天暴露，推荐使用外包装袋将细胞制剂密封后运至病房，也可使用其他洁净容器将细胞制剂运送至病房，一般在2-3h内回输给患者。如果运输需要2—6小时，则需要将细胞制剂保存在4-15℃环境中，推荐使用车载冰箱，如果用保温箱则需要用冰袋降温，并且避免细胞制剂与冰袋直接接触。如果运输过程需要6小时以上，则需要用液氮运输。在到达目的地之后，在洁净实验室中将细胞复苏，制备成临床用的细胞悬液，再供临床使用。
八、临床应用/ _* m7 ~& D4 s+ j/ Y2 V: S, g% W" |
1.免疫细胞治疗技术临床应用和伦理原则：
免疫细胞治疗要科学性原则、不伤害和低伤害原则、知情同意原则、对病人有利原则、尊重原则。必须经过使用单位伦理委员会的论证并同意。在临床方案制定中，要避免免疫细胞与免疫抑制剂同时使用，如果需要配合治疗要按照序贯治疗的顺序避免治疗方法冲突。对不适合增强免疫力的疾病和体质（如接受器官移植者、卡氏评分小于40分等），要慎重使用细胞免疫治疗。特别提示，细胞免疫治疗后的化疗、放疗等有损机体免疫力的治疗，有可能对免疫治疗的远期效果带来负面影响。) W/ v8 {0 P+ @, ^- q
2、免疫细胞临床应用方案
根据病人肿瘤的大小、肿瘤分化、分期、肿瘤转移情况、病人年龄范围、手术情况、卡氏评分和病人体质等诸多因素，综合考虑制定具体治疗方案。推荐使用多种细胞多靶点、多种治疗方法联合治疗方案。需要配合化疗等损伤免疫力的治疗方法，推荐在细胞采集后与细胞回输前的间期进行；提升免疫力的辅助治疗可在细胞回输期间同时进行。细胞采集前可进行改善细胞免疫性状的前期治疗方法。
临床规范治疗方案，推荐由临床医生与实验室医生协商制定，由临床医生组织实施。如采用异体免疫细胞治疗，则需要密切观察不良反应，回输的细胞数量应该按照由少到多的原则，根据不良反应的轻重制定下次回输的细胞剂量。* C; z5 j2 |; h" \* m) D
3.免疫细胞治疗前的准备工作：
基本要求：免疫细胞治疗前应履行告知义务，病人或病人委托人签署治疗知情同意书。按照输血常规的项目检测感染指标、肿瘤相关影像学检查、肿瘤标志物、肝肾功、血常规等。如果伴有其他疾病应做相应的检查。有条件的单位应做免疫指标检查。
更高要求：全套基因检测，循环肿瘤细胞（CTC）检测，检测肿瘤组织干细胞，淋巴细胞CTL-A4、PD-1标志检测。4 M+ G: v  F4 N
4、细胞输注的途径、方式、方法和预处理：/ s8 y9 S$ l! B4 \0 U0 U
CTL、TIL、CIK、NK等免疫杀伤细胞，一般采用静脉输注治疗的方式，也可以采用局部输注治疗的方式（介入治疗）。DC等免疫递呈细胞采用以皮下注射为主的治疗方式，在皮下注射的同时，也可以部分静脉注射。DC细胞皮下注射部位：根据病情，选择容易使DC细胞通过淋巴管到达肿瘤部位，或肿瘤易转移的淋巴结部位。CIK、CTL、NK、TIL等杀伤细胞输注，必须用输血器，以防止细胞团阻塞血管。静脉输注细胞治疗前30分钟，可用非那根等抗过敏药物预防过敏反应，可用解热镇痛类药物预防发热反应。避免应用糖皮质激素类和其他免疫抑制剂预防不良反应。2 W; Q+ c. D4 i5 r5 J
5、免疫细胞治疗后检查项目：% y6 o9 l/ Y! W1 m+ W( A; d1 Z" c$ `
复查基本要求中的肿瘤相关项目，更高要求中除了基因检测外的其他项目。 ; q( [' x& Y/ J" @
九、不良反应的控制和处理措施
在不危及生命的前提下，一般发热和细胞注射完毕4小时后的高热，推荐使用解热镇痛类药物，避免使用糖皮质激素类药物。如果发生严重的过敏反应（如过敏性休克）或输注细胞后短时间内发生剧烈寒战、或有过敏性休克的趋势，则立即注射糖皮质激素类药物，终止免疫反应，其他治疗按照过敏性休克处理，并保留细胞回输残液备查。. A" K) U) w6 t# G8 r
十、细胞免疫治疗临床评价指标和随访：; c: S/ C% V5 Q3 A1 p- J
基本要求：病人治疗后除了肿瘤相关指标临床检测前后对比外，临床指标主要观察病人饮食、卡氏评分、病人其他伴随疾病病情是否改善，病人体力变化等。建立免疫细胞治疗病人临床资料数据库，完善病人的长期跟踪、随访制度，并按规定进行随访、记录。5 q+ m9 f: ?5 e/ P
更高要求：建立病人细胞样本库、病人组织样本库、病人血清样本库，并与病人临床数据库和随访记录相对应。样本和文本数据保存期限为20年，以备将来可进行回顾性研究。6 j7 a: T* ]7 ^/ F1 X+ P9 b* L
十一、记录和评估制度  Z5 U" y7 H6 J! d# P
实验室要按照国家GMP标准做好各种记录，包括所有的操作记录、细胞检测记录、细胞无菌试验记录、消毒、环境监测、物品进出等各种记录。! h& \; x- k9 Q' P) j; T$ F
临床科室要对病人病情、病程等相关信息做好详细记录，包括病人基本信息、肿瘤相关信息、肿瘤前期治疗过程、肿瘤并发症、接受免疫治疗相关信息、治疗后随访情况等相关记录。( ^, J7 j; W6 ~7 w( B9 j/ ^8 U
临床科室还要定期对接受免疫细胞治疗的病人进行临床评估，包括病人无病生存期、总生存期、治疗后不同分期的肿瘤CR、PR、SD、PD病例的百分比、病人生存质量改善率等临床效果评估；要对免疫细胞治疗的病人进行一般不良反应发生率、严重并发症发生率、是否存在医疗事故等情况进行评估。: `2 ~1 R8 b6 D: o  j. [7 l: ^
临床科室和实验室根据各自的数据，共同提出进一步改善细胞免疫治疗的改进意见，包括实验室方法和临床流程。同时对实验室记录、各种临床记录、随访情况和病历质量等进行客观评价，并提出进一步改进意见和建议。. w8 `+ N+ y- |) g4 W2 e$ Y. p4 o
十二、医疗单位的监管职责6 X$ e; \1 b8 @  z2 y3 X  s8 g
开展细胞免疫治疗的单位在硬件满足的条件下，应先通过本单位的伦理委员会的论证，然后实施。对实施过程参考本《规范》对实施过程进行监管，督促不断改进。要积极准备材料，按照国家有关法律、法规和文件组织申报。: V' f" N) g2 k- g" Y) B
十三、附则7 x5 m4 b/ a9 d; t/ j" F5 h  Z
1、本规范属于山东省细胞治疗业内规范指导性文件，不具备法律效力，由生物医学工程学会干细胞与再生医学专业委员会细胞免疫治疗学组讨论通过后，在承认本规范的学组成员单位中实施，供其他开展免疫细胞抗肿瘤治疗的医疗机构参考。) q- R, L0 w. k7 Q0 [( S; R. W6 f4 _. @
2、本《规范》每年修改一次，如果有必要经学组组长或5名以上学组组员提议可以随时修改。6 W$ t: \  X, A& x
3、如果本规范所涉及内容与国家公布实施的文件或山东生物医学工程学会等上级学会文件相抵触，以国家相关文件和上级学会文件为准。" Q) ^. B: b9 R! X7 J1 [

   山东省生物医学工程学会干细胞与再生医学专业委员会细胞免疫治疗学组
                              2015年4月23日

作者: xingyanchao 时间: 2016-3-18 18:15

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山东省细胞免疫抗肿瘤治疗业内自律性规范! H) t5 g4 T9 \: _% ]3 k) b2 i7 G
--山东省生物医学工程学会干细胞与再生医学专业委员会免疫细胞治疗学组2015年4月23日通过3 p! S4 H8 {: b  D; u
为了保证细胞免疫抗肿瘤治疗的健康、有序的发展，保证医疗安全，为肿瘤病人提供一种安全、有效的治疗方法，根据国家药品监督管理局颁布的《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》和《药品GMP认证检查评定标准》的有关规定，并考虑到多数从事细胞治疗单位现有的条件，按照循序渐进的原则，使我省细胞免疫抗肿瘤治疗领域各项工作逐步走向规范，特制定《山东省细胞免疫抗肿瘤治疗业内自律性规范》，简称《规范》。
一、适用范围7 P4 E& h9 T! X( Y1 i; W! G6 Z6 C9 U# Q: W" G* t2 i% t
本《规范》是山东省细胞免疫抗肿瘤治疗领域业内自律性文件，适用于山东省从事细胞免疫抗肿瘤治疗、并且承认本规范的医疗机构和生物技术企业。细胞免疫抗肿瘤治疗是指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的与免疫有关的体细胞，经体外操作后回输（或植入）人体的抗肿瘤治疗方法，包括树突状细胞（DC）、抗原致敏的树突状细胞（APDC）、淋巴因子激活的杀伤细胞（CIK、DCIK、LAK、CD3AK、TAK）、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、体外致敏的杀伤细胞（IVS、TCL）等，其他未包括的细胞免疫抗肿瘤治疗参照执行。$ ^) K0 V  U6 I5 e0 H7 }
   本规范设定两个要求：基本要求和更高要求。基本要求是指我们目前必须具备条件，更高要求是指今后需要不断改进要达到的最终条件。
二、人员配备要求
1、临床人员要求
①细胞免疫治疗临床科主任（负责人）要求：)
基本要求：从事细胞免疫抗肿瘤治疗临床主要负责人须具备副高或以上职称，工作责任心强，具备2年以上从事细胞免疫抗肿瘤治疗的临床工作经验、具备较系统的临床免疫学知识，具有处理细胞免疫治疗过程中可能出现的各种不良反应的能力和相应的细胞免疫抗肿瘤治疗知识，能指导下级医师从事免疫细胞治疗工作；细胞免疫治疗临床负责人担负着培训其他参与此项目的临床医师的职责，并及时与实验室负责人协商，协调病人的治疗方案。$ K0 ~: g7 X! U
更高要求：在具备基本要求的基础上，经过较系统的免疫细胞治疗培训，具备系统的临床免疫学知识，掌握一定的基础免疫学知识，了解实验室细胞制备流程和方法，掌握细胞免疫抗肿瘤治疗与其他疗法联合治疗方案的制定原则，具备临床科研能力。; Y# D' e$ f: F2 y
②细胞免疫治疗临床医师要求：" B4 r; I$ N$ ]$ Y+ X8 B9 d. x0 ]% ~4 a
基本要求：从事此项目临床治疗的医师必须具备本科或本科以上学历，须具有基本的免疫治疗知识，经过各单位组织的基本培训，掌握免疫治疗过程中不良反应的处理方法和急救方法。7 F( e) @: M* I, B
更高要求：在具备基本要求的基础上，临床免疫治疗的医师经过系统专业培训，具备较为系统的临床免疫学知识，并能解释免疫治疗中出现的临床现象。5 y" R/ R: j( {( O* s
2、实验室人员要求) A8 G' G+ o. u- ~
①实验室技术人员要求：
基本要求：具备大学（专）本科或以上学历，具有医学或生物学实验室学习或工作经历，具备一定的基础免疫学知识，经免疫细胞培养培训1个月以上，能识别培养细胞中是否存在微生物污染，会观察细胞生长状态。能正确履行其职责的实验室技术人员。
更高要求：具备医学检验系大学（专）本科学历，或具备细胞培养1年以上学习经历的研究生学历，再经3个月以上免疫细胞制备培训或实习，或具有不少于50例实验性免疫细胞制备经验，方可独立操作。
②实验室主任（负责人）要求：
基本要求：具备副高级或以上职称、具备较系统的基础免疫学知识，并具有2年以上从事细胞免疫抗肿瘤治疗的实验室工作经验，能够指导实验室技术人员工作，具备解决在免疫细胞培养过程中出现的复杂问题，对本规范的实施、实验室安全和制备的免疫细胞的质量负责。承担与临床科室沟通的职责。
更高要求：在基本要求的基础上，具备系统的基础免疫学知识和临床免疫学知识，了解细胞治疗的临床流程，具备基本的基础科研能力，有一定的临床科研知识。具备相关疾病的基本的临床知识。能及时掌握国内外最新的细胞免疫治疗的最新动态。  f# ]' ?2 m6 e
③其他人员要求：% |" }( Q; h. \0 S' q( c2 u
基本要求：从事质量检验的工作人员以及其他需要进入洁净实验室（GMP实验室）的工作人员（包括维修、辅助人员）应在实验室技术人员的指导下，按照进入洁净实验室的流程进入实验室，应具备一定的微生物学基础和洁净作业等方面的知识。' c7 x! ~1 d" i+ E# o7 j: y
更高要求：在基本要求的基础上，经过一定的洁净实验室工作培训，掌握微生物学知识，培训有记录。  b' I: ]* G3 z( }. n8 |/ k$ J( X( f1 _
④单位职责：- v: i5 c' M2 \9 [" ^8 J$ Z2 @: p& Z
各单位应建有对各级员工进行本规范和专业技术、岗位操作知识、安全知识等方面的培训制度、培训计划和培训档案，并按照有关规定定期检查，有检查记录。
三、材料和设备配备要求
1.试剂和耗材准入! 4 R* s. R1 {+ c0 L0 ?7 K$ w
基本要求：用于临床治疗的细胞悬液制备所需试剂和器械均必须经食品药品监督管理部门审批，具有临床应用的许可证，即注射到病人体内的配制细胞悬液所用液体和添加剂必须使用国药准字号药品，接触细胞悬液的包装材料必须具备医疗设备注册证。一次性耗材禁止重复使用。用于细胞分离、纯化和培养的试剂和耗材以及各种添加剂，均应该符合药品生产企业使用的试剂和耗材的质量标准，每批耗材和试剂均需要有出产厂家的质量检测报告，报告需长期保存。所使用的试剂和耗材以及它们的质检报告均要建立登记制度，保证材料来源的可追溯性。
更高要求：在基本要求的前提下，所有的试剂和耗材均有食品药品监督管理部门颁发的注册证书。! w- x: _( Q: D) M
2.耗材和试剂存放4 @! Y2 Q4 M/ }( `& i7 V
基本要求：耗材应按品种、规格、批号分别存放，库房干燥、洁净，物品名称标签和进货日期标识清楚，库房存放的物品必须有外包装，洁净实验室存放的物品不得带有外包装，可以有内包装。对培养液和试剂等对温度、湿度或其他条件有特殊要求的试剂和材料应按规定条件贮存。库房存储的物品出入记录清楚，定期盘点。
更高要求：库房要求恒温、自动除湿、有空气净化系统。 * x- E& e1 J- F
3.试剂和耗材使用：4 Z2 R/ B- N; M4 x" L2 f& {
基本要求：培养基、培养基添加成分和能接触到培养液的用品必须符合国家药品监督管理局2003年3月20日颁布的《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》标准。可以使用异种血清，推荐使用病人自体血清或血浆。更高要求：商业来源的培养基，应由厂商提供全部培养基成分资料和质量检测报告。采用无血清培养液、可添加病人自体血清或自体血浆，尽量避免使用内酰胺类抗生素。
4、设备配备要求
基本要求：各种细胞制备设备均安放在符合GMP标准的洁净实验室内，主要包括：CO2培养箱、超净工作台、大容量水平离心机、倒置显微镜、加样枪等以及配套设备。检测设备可按临床实验室环境安放，检测设备包括：流式细胞仪。储存设备：细胞储存用超低温冰箱（-80℃），试剂和培养液储存冰箱等。如果较远距离运输（运输时间半小时以上），需要用保温箱（4-15℃）。储存设备应安放于较为洁净的环境中，检测设备应有独立的房间。- P" T  @- `* L6 b# C. z+ f1 j8 q
更高要求：除了满足基本要求外，细胞制备设备中CO2培养箱，推荐使用具备自动消毒、带有空气过滤功能的培养箱，操作台推荐使用生物安全柜，离心机推荐使用无碳刷、大容量恒温水平离心机，倒置显微镜应带有图像采集系统。检测设备流式细胞仪外，可配备ELI-SPOT检测设备，可根据需要配备部分用于科研设备。储存设备中推荐使用液氮箱，超低温冰箱（-80℃）和试剂和培养液储存冰箱应带有温度自动记录系统，并且配有备用冰箱。细胞运输用保温箱（4-15℃）推荐使用车载冰箱。细胞冻存降温应配备程控降温仪。如果使用组织或细胞制备肿瘤抗原应配备非接触式细胞超声破碎仪。根据需要可配备纯水系统。& {) D" b1 ~3 T# f( y! E
四、细胞制备环境要求/
1、细胞采集要求
基本要求：细胞采集应在细胞采集室或治疗室中进行，采集环境需要按照治疗室的规定按期消毒，并进行无菌检测。采集的细胞量要达到能制备出临床所需细胞数量的要求，以DC细胞为主的治疗必须使用血细胞分离机。病人的体质能耐受细胞采集全过程。采集室具备抢救车和简易急救设备。有左心衰症状的病人慎用血细胞分离机。
更高要求：如果病人身体状况允许，应使用血细胞分离机采集病人外周血中单个核细胞。采集数量：单个核细胞数不低于1×109,单核细胞数不低于2×108。如果病人经多次化疗或放疗，应适当增加细胞采集数量。: R; [7 a( g0 z! T
2.细胞制备环境要求：
基本要求：采集的细胞进一步处理需要在达到国家GMP标准的洁净实验室中进行，设备和物品摆放、储存必须符合国家GMP的规定。洁净实验室内需配备百级净化超净工作台或生物安全柜，细胞培养的各种暴露性操作应在超净工作台或生物安全柜中操作。提倡一个病人的样本两人独立操作。操作间设置简单，无死角。人和物的通道分离。所有使用的物品均不能产生粉尘和纤维脱落，洁净实验室墙壁无粉尘。进入洁净实验室的物品尽可能保持无菌。洁净实验室定期消毒，空气过滤器定期更换，并进行空气微生物培养，有记录。细胞培养箱应放置在万级或万级以上的净化级别环境中。8 k8 n/ E' T% p7 w9 g
更高要求：GMP实验室废弃物品通过专用通道，经消毒后离开洁净实验室。人员进入和离开通道分离。每两周检测一次空气微生物。每半年检测一次实验室净化级别，要保持实验室洁净度不低于万级，有记录。实验室有摄像监控。% J1 X, b: D  |, a2 `, Y$ @" J
3. 洁净实验室衣物穿戴要求:
基本要求：洁净实验室使用的无菌服制作材料要求耐高温、无脱落纤维或粉尘、不产生静电。将这种材料制成连体衣，包含帽子、上衣、裤子和袜子4部分为一体。衣服每周高温消毒一次。进入洁净实验室衣物穿戴程序依次为：换鞋、消毒手和前臂、戴一次性口罩和帽子、穿无菌猴服、再次换鞋、戴无粉尘无菌手套，进入实验室。头发需全部包进帽子里，不得外露。所用拖鞋每1—2周消毒液浸泡消毒一次。: X3 w! j* O3 c) w6 d& z+ _5 \
更高要求：要求进出实验室前先洗澡，换实验室内衣，然后，再按照上述流程进入实验室。无菌猴服使用完毕后放入臭氧消毒柜（或其他消毒柜）中消毒，备下次使用。
4.具有感染性样本来源的免疫细胞制备' m; S8 d( [, D
基本要求：需使用单独的净化区域。若无单独的净化区域，需操作完毕后，彻底消毒，然后再进行其他病人治疗。3 r2 m! y# ?# s* ?
更高要求：感染样本处理需要有独立的洁净实验室，独立的空气净化系统，专用生物安全柜，生物安全柜气体外排，不进入循环。)! e9 F' K: c" g: b
5.洁净实验室检测：6 v# m' B5 r* F9 ]& ]5 j4 Z$ ]
基本要求：每半个月应监测洁净实验室、操作台和培养箱的微生物数，怀疑有污染随时检测，彻底清除污染后必须检测合格后方能使用。
更高要求：各实验室之间、不同洁净度的区域之间有空气压差检测装置，并有记录。& @" {; |2 C! W9 `, h0 z# [- x
6.实验室微生物检测方法：
直径10cm的培养皿暴露在操作台内1小时，不应有微生物存在；暴露在细胞培养箱中和洁净实验室内3小时，微生物数不能大于1个菌落，不能有致病菌和霉菌存在。每次检测要有记录。4 Z+ E) u* C7 U. ^! A% {# B
五、治疗所用细胞来源
1.如果条件允许，尽可能采用病人自体细胞进行免疫治疗。不得采用异种细胞。. `/ N. _- r1 f, P& M) i2 Q
2.如果采用同种异体细胞，则需要说明供体的年龄、性别，供体必须符合国家对献血员的要求，并提供测试的方法及符合条件的依据。供体必须经过检验证明HBV抗原、抗HCV、抗HIV-1/2、梅毒抗体、细菌、霉菌均为阴性，必要时需说明供体的既往病史、家族史等临床资料。还必须对供体做HLA-I类和II类分型检查，并证明与受体（病人）相匹配，同时提供检测方法和依据。应注明供者的来源并加以标记。
六、细胞制备的技术指标和质量控制
1.实验室质控负责人要求：* D- B; e9 g% k; }$ D
基本要求：实验室质量负责人应负责细胞制备全过程的质量管理和检验，能独立履行其职责。负责对制备的细胞样本进行质量（如细胞标志物、存活率、杀伤试验等）、数量和微生物学检验（如细菌、真菌、支原体和内毒素检验），并按试验原始数据如实出具检验报告。推荐采用第三方检测。
更高要求：对不同时期的质控结果提供客观的分析报告，并提出改进意见和建议。
2.细胞培养方法要求：  b. g5 _& I& X' V
基本要求：建议1份样本一分为二，两人用各自的试剂独立操作。DC等抗原递呈细胞制备须使用自体血清或无血清培养液，不能使用异种血清（如牛血清等），可使用少量同种异体血清（如人血清、脐血清等）。DC一般要采用自体细胞制备，尽可能避免使用异体细胞制备DC。
CIK、NK等MHC非限制性杀伤细胞培养，推荐使用自体来源细胞制备，培养液可添加异种血清、同种异体血清和自体血清，推荐使用无血清培养液或添加自体血清的培养液。如果使用同种异体细胞制备，则每批应注明细胞来源并加以标记、做好配型、注明供者的详细信息。! q8 {% O- E4 R* C8 V4 [# W
CTL、TIL等MHC限制性杀伤细胞培养，推荐使用自体来源细胞制备，也可采用同种异体细胞制备（CTL），培养液可添加同种异体血清和自体血清，推荐使用无血清培养液或添加自体血清的培养液，在抗原递呈细胞存在的前提下避免使用异种血清。如果使用同种异体细胞制备，则每批应注明细胞来源并加以标记、做好配型、注明供者的详细信息。
更高要求：在满足基本要求的基础上，DC等抗原递呈细胞培养末期，要监测不成熟细胞比例，可采用一切可行的方法，减少不成熟DC的比例。# o) a* y) F9 f( N( |
CIK、NK等MHC非限制性杀伤细胞培养末期，监测Treg细胞比例，鼓励探索提高细胞毒性的培养方法，可采用可行安全的方法减少Treg的比例。6 J+ `: D6 l8 l$ b0 e& p
CTL、TIL等MHC限制性杀伤细胞培养，推荐使用TIL替代CTL治疗，CTL培养推荐使用特异性细胞毒性T细胞经纯化后的培养方法。, @/ }  {0 h6 `$ v1 Y8 p  F2 u
3.回输免疫细胞质量标准：- r  U2 _' P% F
基本要求：所有临床使用细胞微生物检测指标均为阴性；存活率不低于80%（台盼蓝拒染率）。DC质量标准：CD11c+CD86+双阳性细胞不低于70%，CD11c+CD83+不低于50%，每个疗程有效DC细胞不应小于50×106。
CIK、NK质量标准：CIK细胞CD3+CD8+双阳性细胞和CD3+CD56+阳性细胞总和不小于60%，NK细胞CD3-CD56+细胞比例不低于50%，每个疗程CIK、NK细胞总数不小于50×108。
CTL、TIL质量标准：CD3+CD8+细胞不小于70%，每个疗程治疗细胞总数不低于50×108
更高要求：增加体外检测制备的免疫细胞应具备的生物学功能和生物学效应，比如免疫细胞具有的某种生物学功能，分泌某种产物的能力，表达某种标志的水平等。细胞存活率不低于95%（台盼蓝拒染率）；DC质量标准：CD11c+CD86+双阳性细胞不低于90%,CD11c+CD83+不低于80%，每个疗程有效DC细胞不应小于100×106，检测其递呈的肿瘤特异性抗原在DC细胞膜上的表达率；  I- i6 O& C$ ^7 K1 r
CIK、NK质量标准：CIK细胞CD3+CD8+双阳性细胞和CD3+CD56+阳性细胞总和不小于80%，NK细胞CD3-CD56+细胞比例不低于50%，每个疗程CIK、NK细胞总数不小于100×108，CIK和NK细胞检测对靶细胞的杀伤率（可采用恶性黑色素瘤细胞株为靶细胞），同时检测CD4+CD25+FOXP3+阳性细胞比例（Treg），其比例要小于5%；
CTL、TIL质量标准：CD3+CD8+细胞不小于90%，每个疗程治疗细胞总数不低于100×108。检测细胞在特异性肿瘤抗原刺激下，分泌IFN-r的细胞的比例。
4.细胞制备记录要求
基本要求：各种免疫细胞制备过程均有详细记录，包括细胞采集数量，获得单核细胞数量、制备方法、使用的培养液和添加剂的数量、批号等相关信息。自体免疫细胞制备及鉴定过程的原始记录和检测报告，并永久保存备查。其他相关操作也要有详细的操作记录。' n( u2 }$ q; S
5、标记要求：
所有物品使用或启封后都要有标记，保存的物品、分装试剂、细胞、样本也同样要有标记。标记内容包括：物品种类、名称、日期、添加的因子名称及数量和操作人等内容。标记内容清楚、不易脱落。发送的细胞要注明病人姓名、性别、年龄、科别、住院号、细胞种类、细胞数量、制备时间和操作者等相关信息。
七. 细胞保存与运输4 ]/ J# C. D  Q
1、细胞保存与冻存细胞复苏：细胞如果在制备结束后2小时内完成细胞输注放置室温保存即可；如果需要放置2—6小时，则细胞必须保存在4-15℃环境中（冰箱或保温箱）；如果需要长期保存，细胞需要按照一定的浓度加入细胞冻存液，逐渐降温至适宜的温度（-20℃— -80℃）。如果保存6个月以内，可放置于-80℃超低温冰箱中保存。如果需要保存时间超过6个月，则必须在液氮中保存。液氮中细胞保存时间可达到20年。细胞冻存降温推荐采用程控降温仪，也可采用冻存盒和其他可行的降温方法。细胞复苏则需快速升温的方法，推荐使用恒温循环水浴箱，也可使用其他方法复苏细胞。要尽可能避免在细胞解冻的熔点温度时间过长。鼓励对细胞放置6—24小时内添加细胞营养添加剂的研究和探索。% p& {7 L* m" C& j
2、细胞运输：+ q2 |9 j5 W0 x. o1 {2 o
细胞从实验室送至病房途中，细胞制剂不能露天暴露，推荐使用外包装袋将细胞制剂密封后运至病房，也可使用其他洁净容器将细胞制剂运送至病房，一般在2-3h内回输给患者。如果运输需要2—6小时，则需要将细胞制剂保存在4-15℃环境中，推荐使用车载冰箱，如果用保温箱则需要用冰袋降温，并且避免细胞制剂与冰袋直接接触。如果运输过程需要6小时以上，则需要用液氮运输。在到达目的地之后，在洁净实验室中将细胞复苏，制备成临床用的细胞悬液，再供临床使用。1 a5 \; t, L* A4 K; B
八、临床应用9 Q2 U! W9 Q2 b& E
1.免疫细胞治疗技术临床应用和伦理原则：
免疫细胞治疗要科学性原则、不伤害和低伤害原则、知情同意原则、对病人有利原则、尊重原则。必须经过使用单位伦理委员会的论证并同意。在临床方案制定中，要避免免疫细胞与免疫抑制剂同时使用，如果需要配合治疗要按照序贯治疗的顺序避免治疗方法冲突。对不适合增强免疫力的疾病和体质（如接受器官移植者、卡氏评分小于40分等），要慎重使用细胞免疫治疗。特别提示，细胞免疫治疗后的化疗、放疗等有损机体免疫力的治疗，有可能对免疫治疗的远期效果带来负面影响。
2、免疫细胞临床应用方案" t/ E( P9 J6 [# p( \; X
根据病人肿瘤的大小、肿瘤分化、分期、肿瘤转移情况、病人年龄范围、手术情况、卡氏评分和病人体质等诸多因素，综合考虑制定具体治疗方案。推荐使用多种细胞多靶点、多种治疗方法联合治疗方案。需要配合化疗等损伤免疫力的治疗方法，推荐在细胞采集后与细胞回输前的间期进行；提升免疫力的辅助治疗可在细胞回输期间同时进行。细胞采集前可进行改善细胞免疫性状的前期治疗方法。. y" A% E* Q  g0 Z
临床规范治疗方案，推荐由临床医生与实验室医生协商制定，由临床医生组织实施。如采用异体免疫细胞治疗，则需要密切观察不良反应，回输的细胞数量应该按照由少到多的原则，根据不良反应的轻重制定下次回输的细胞剂量。
3.免疫细胞治疗前的准备工作：
基本要求：免疫细胞治疗前应履行告知义务，病人或病人委托人签署治疗知情同意书。按照输血常规的项目检测感染指标、肿瘤相关影像学检查、肿瘤标志物、肝肾功、血常规等。如果伴有其他疾病应做相应的检查。有条件的单位应做免疫指标检查。5 y$ d7 C* ]6 V' n' L
更高要求：全套基因检测，循环肿瘤细胞（CTC）检测，检测肿瘤组织干细胞，淋巴细胞CTL-A4、PD-1标志检测。
4、细胞输注的途径、方式、方法和预处理：
CTL、TIL、CIK、NK等免疫杀伤细胞，一般采用静脉输注治疗的方式，也可以采用局部输注治疗的方式（介入治疗）。DC等免疫递呈细胞采用以皮下注射为主的治疗方式，在皮下注射的同时，也可以部分静脉注射。DC细胞皮下注射部位：根据病情，选择容易使DC细胞通过淋巴管到达肿瘤部位，或肿瘤易转移的淋巴结部位。CIK、CTL、NK、TIL等杀伤细胞输注，必须用输血器，以防止细胞团阻塞血管。静脉输注细胞治疗前30分钟，可用非那根等抗过敏药物预防过敏反应，可用解热镇痛类药物预防发热反应。避免应用糖皮质激素类和其他免疫抑制剂预防不良反应。1 N0 w. @% y; p7 Y& g; ?' F' D+ v
5、免疫细胞治疗后检查项目：- m! T: T2 n! y+ c- |# S
复查基本要求中的肿瘤相关项目，更高要求中除了基因检测外的其他项目。 # ]% m$ B  w, I: G9 E: U, n7 D
九、不良反应的控制和处理措施
在不危及生命的前提下，一般发热和细胞注射完毕4小时后的高热，推荐使用解热镇痛类药物，避免使用糖皮质激素类药物。如果发生严重的过敏反应（如过敏性休克）或输注细胞后短时间内发生剧烈寒战、或有过敏性休克的趋势，则立即注射糖皮质激素类药物，终止免疫反应，其他治疗按照过敏性休克处理，并保留细胞回输残液备查。& @' M! r' t  h9 k
十、细胞免疫治疗临床评价指标和随访：  H5 f' y) G% N- M3 k' R
基本要求：病人治疗后除了肿瘤相关指标临床检测前后对比外，临床指标主要观察病人饮食、卡氏评分、病人其他伴随疾病病情是否改善，病人体力变化等。建立免疫细胞治疗病人临床资料数据库，完善病人的长期跟踪、随访制度，并按规定进行随访、记录。# ?( E2 U6 A. V8 N0 ?+ K
更高要求：建立病人细胞样本库、病人组织样本库、病人血清样本库，并与病人临床数据库和随访记录相对应。样本和文本数据保存期限为20年，以备将来可进行回顾性研究。
十一、记录和评估制度
实验室要按照国家GMP标准做好各种记录，包括所有的操作记录、细胞检测记录、细胞无菌试验记录、消毒、环境监测、物品进出等各种记录。; T, C3 F) O" T8 J+ W5 w: I
临床科室要对病人病情、病程等相关信息做好详细记录，包括病人基本信息、肿瘤相关信息、肿瘤前期治疗过程、肿瘤并发症、接受免疫治疗相关信息、治疗后随访情况等相关记录。
临床科室还要定期对接受免疫细胞治疗的病人进行临床评估，包括病人无病生存期、总生存期、治疗后不同分期的肿瘤CR、PR、SD、PD病例的百分比、病人生存质量改善率等临床效果评估；要对免疫细胞治疗的病人进行一般不良反应发生率、严重并发症发生率、是否存在医疗事故等情况进行评估。) R4 W0 X5 b4 w( w, [  _4 K
临床科室和实验室根据各自的数据，共同提出进一步改善细胞免疫治疗的改进意见，包括实验室方法和临床流程。同时对实验室记录、各种临床记录、随访情况和病历质量等进行客观评价，并提出进一步改进意见和建议。* o/ z' W. c' ~. M  k6 Z
十二、医疗单位的监管职责
开展细胞免疫治疗的单位在硬件满足的条件下，应先通过本单位的伦理委员会的论证，然后实施。对实施过程参考本《规范》对实施过程进行监管，督促不断改进。要积极准备材料，按照国家有关法律、法规和文件组织申报。6 Y5 A/ Q, T1 C/ Q6 d
十三、附则
1、本规范属于山东省细胞治疗业内规范指导性文件，不具备法律效力，由生物医学工程学会干细胞与再生医学专业委员会细胞免疫治疗学组讨论通过后，在承认本规范的学组成员单位中实施，供其他开展免疫细胞抗肿瘤治疗的医疗机构参考。
2、本《规范》每年修改一次，如果有必要经学组组长或5名以上学组组员提议可以随时修改。
3、如果本规范所涉及内容与国家公布实施的文件或山东生物医学工程学会等上级学会文件相抵触，以国家相关文件和上级学会文件为准。6 p5 D8 n9 o( ^8 b6 q; D1 n1 Z$ M
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   山东省生物医学工程学会干细胞与再生医学专业委员会细胞免疫治疗学组. S" Q# {' I3 Q
                              2015年4月23日

作者: lgfffancy 时间: 2016-3-19 11:37

回复 xingyanchao 的帖子
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thanks a million,这个确实在之前看到过。谢谢分享。

作者: 994545 时间: 2016-3-20 18:57

不管是NK或CIK监管机制太弱基本都做不到本该有的作用。

作者: lccsiais 时间: 2016-3-23 11:25

回复飞翔的烨的帖子: A( Q- N' H3 b+ \+ _
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牛！
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邓学文教授在日本搞的就是他自己发明的无饲养细胞大规模NK扩展方法，每年几千人使用，很多人是用来做保健的。
陈颂雄医生搞定的三种基因改造NK，包括Car-NK，搞到了很多投资。但后来又有Car-NK疗效还不理想的说法。8 ]& O* S" t' h
比较起来，CIK对肿瘤患者疗效可能更好，临床数据也很多，CIK也有明显的保健作用。

作者: 常青树 时间: 2016-4-19 10:38

个人认为，CIK用在实体瘤的效果应该优于NK，NK可能在经淋巴转移的肿瘤的防止转移上略胜一筹。

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