干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站
标题:
CAR-T细胞培养中慢病毒转染的问题
[打印本页]
作者:
六弦七品
时间:
2016-3-24 10:42
标题:
CAR-T细胞培养中慢病毒转染的问题
最近养CAR-T细胞转染效率老是上不去，大家病毒滴度一般用多少？转染后细胞状态明显变差，照理说用的慢病毒都是缺陷病毒，不能复制，进入细胞后又不会消耗细胞营养，为什么对细胞损伤这么高？
作者:
zmfang555
时间:
2016-3-24 14:14
你是不是用了polybrene?如果用了这个增强剂的话,会对细胞产生毒性,毒性强度与你加的量有关.
作者:
六弦七品
时间:
2016-3-25 11:35
回复
zmfang555
的帖子
o) L: T$ y5 @" t
8 J4 l B7 A3 ~# T0 d/ s
没用增强剂，有人说是慢病毒的VSVG蛋白对细胞有毒性，做过的人有遇到类似情况吗？
作者:
winqi
时间:
2016-3-25 16:46
polybrene 肯定有毒性的，而且毒性还比较的大，需要换，你用的cmv还ef-1a作启动子啊？这两个可能有不同！
作者:
riverdtang
时间:
2016-3-28 10:35
你是CART转不进去还是病毒转不进去， 如果只是CART的话要考虑载体和病毒的问题，比如启动子啊，滴度，转染时机等，如果对照GFP都转不进去的话可能就是体系或者细胞的问题了
作者:
六弦七品
时间:
2016-3-30 09:41
回复
riverdtang
的帖子
* q$ A* @$ Q! r7 p' @6 l. q
" l( P8 g1 O& O& J3 b
我们转T细胞的同时转293T，293T是可以检测到CAR的，T细胞检测不到，现在不知道问题出在哪
作者:
riverdtang
时间:
2016-3-30 09:49
回复
六弦七品
的帖子
z/ R( a* e" v/ a: _ z1 z6 X
# ^2 P, \2 s/ ]' Q
T细胞可比293T难转多了，293T只要活着、状态不差，都能转进去的，T细胞分离后转染的时机，MOI，刺激的条件都很重要，建议你还是用GFP病毒转一下T细胞，优化T细胞本身的转染效率再转CAR
作者:
ET生物人
时间:
2016-3-30 13:19
慢慢发现，不同人的T细胞感染效率差异有点大！！你们做的T细胞是来自哪里？来源稳定吗？
作者:
木子小王令
时间:
2016-3-30 14:20
回复
riverdtang
的帖子
* m: `% w* h' B; V
( R5 k1 M4 J+ F$ h L. b1 A4 Y
你好！我是刚接触慢病毒转Tcell的实验，请问初始摸索的过程中，一般慢病毒转染Tell的时机，细胞接种量，MOI可以设定多大的梯度范围呢？我试过一次，Tell接到6孔板中是3×10^5/well，MOI为200，作用时间48h都没有换液，细胞状态还是很好，但是转染效率很低，不足10%的样子。
作者:
riverdtang
时间:
2016-3-30 16:24
回复
木子小王令
的帖子
8 F# t9 ^( |8 h: ^
0 k; [9 ] s+ F6 Z
T细胞分离后用抗体刺激48h转，MOI：10-50我们的转染率就很高了，50%以上吧，感染第二天换液，铺板密度10^6/ml都可以，我觉得可能还是细胞激活的问题
作者:
yanxm920
时间:
2016-3-30 16:44
没有遇到过呢
作者:
木子小王令
时间:
2016-3-30 16:56
回复
riverdtang
的帖子
3 F* D }% S/ L9 u4 h6 n0 p
5 k$ L. O" F$ Y# c2 l( P
是的，感觉自己还是操作有问题。
/ u/ u! E1 _ ^2 M
是别人给的培养第九天的Tcell，我每孔取了3×105接的。因为以前慢病毒转染时候一般都是在转染时细胞汇合度达30~50%，所以这回转Tcell也想当然的沿用这个规律。
" S9 m3 v5 j( {# C0 t- f: P
$ d- O3 {. I" _" D$ l! J4 {+ T1 m
请问你是在Tcell初始分离后就开始用抗体刺激吗？是不是这个时期的Tcell活力比较高呢？（我之前用的Tcell是不是有点老了？）
7 i5 b" i# J( ?# T& D7 x. d
% y* l+ N2 e) B6 V' i8 a8 E/ T
铺板密度如果是10^6/ml，6孔板铺1ml就可以的吧？接种第二天做转染，然后24h后再换液？
) k- _$ A: O7 l+ m+ t8 ]2 Y
作者:
riverdtang
时间:
2016-3-30 17:55
回复
木子小王令
的帖子
6 |( ~7 p: D& }9 @! ]0 ?
; f8 j; @2 \) a' p
是的，第九天转那效率肯定不会很高的，我们分离就刺激，浓度看你们所需的细胞种类和抗体质量了，这个需要摸索一下，不过你们可以长到第九天还有10%转染率，那刺激可能不是最大的问题，你可以试下分离2-3天转，可能会好些。悬浮细胞不需要铺板啊，直接转就是了，第二天换液。
作者:
木子小王令
时间:
2016-3-31 09:13
回复
riverdtang
的帖子
# q5 R& a6 o' S% ^; y
3 E- ^2 {) y+ _. o& G
恩恩！谢谢大神！
& i# u. k% U. M8 w
我下次试着做个梯度，有问题还请多多指教！！！
作者:
ET生物人
时间:
2016-3-31 09:35
回复
riverdtang
的帖子
- ]# w8 ~+ k1 R" B: y6 v7 t
9 y3 ]5 C4 x0 u# ?8 b
你们是用什么培养液的？？怎么转染率这么高，我们感染效率一直都很不稳定。
作者:
六弦七品
时间:
2016-3-31 10:16
回复
riverdtang
的帖子
- B$ [+ O; y8 j# C
6 C( |4 j& `- D. z9 X6 _' Y, ?
你们转染效率这么高，我们都用了RetroeNection加polybrene，还是没多少，应该是载体有问题，你们用的那种载体？
作者:
六弦七品
时间:
2016-3-31 10:18
回复
winqi
的帖子
+ U) _4 _0 I9 B/ x3 L. f2 `
7 S' a% c" o8 |; o/ y- }
用的CMV，最近准备换ef-1a
作者:
riverdtang
时间:
2016-4-1 10:52
回复
六弦七品
的帖子
9 C. X1 X6 [ Z- p
1 T( |9 d% _' Q! U
启动子试过没有什么明显的差别，还是转染时机影响吧，分离激活后尽早转会好些
作者:
jinhaifeng
时间:
2019-1-11 14:06
回复
riverdtang
的帖子
7 a+ \) h1 L4 P! l4 t0 A
/ b, O5 i2 ]; Q3 f4 ?, S# T5 Q6 M
请问你们用聚凝胺了吗
作者:
只因偶然
时间:
2020-2-10 21:23
回复
riverdtang
的帖子
7 r# u0 y" g' e4 _/ N8 ^
6 s' E3 d2 y8 |! n
你们测转染率是什么时候测的？为什么我们养的CAR-T，转染第5天后（转染第2天换液），细胞增殖速度变慢，活性下降了呢
作者:
只因偶然
时间:
2020-3-1 12:01
回复
riverdtang
的帖子
" B- P/ w7 A7 }' g2 Z2 s. s9 G
0 r0 B4 ~, n( `: l$ m4 ^) a9 g
你好，我做car-t，慢病毒感染后第5天开始细胞生长速度变慢，不知道是什么原因
欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)
Powered by Discuz! X1.5
