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标题: CAR-T细胞培养中慢病毒转染的问题 [打印本页]

作者: 六弦七品 时间: 2016-3-24 10:42 标题: CAR-T细胞培养中慢病毒转染的问题

最近养CAR-T细胞转染效率老是上不去，大家病毒滴度一般用多少？转染后细胞状态明显变差，照理说用的慢病毒都是缺陷病毒，不能复制，进入细胞后又不会消耗细胞营养，为什么对细胞损伤这么高？

作者: zmfang555 时间: 2016-3-24 14:14

你是不是用了polybrene?如果用了这个增强剂的话,会对细胞产生毒性,毒性强度与你加的量有关.

作者: 六弦七品 时间: 2016-3-25 11:35

回复 zmfang555 的帖子8 X7 p( [8 v% @% F" {

没用增强剂，有人说是慢病毒的VSVG蛋白对细胞有毒性，做过的人有遇到类似情况吗？

作者: winqi 时间: 2016-3-25 16:46

polybrene 肯定有毒性的，而且毒性还比较的大，需要换，你用的cmv还ef-1a作启动子啊？这两个可能有不同！

作者: riverdtang 时间: 2016-3-28 10:35

你是CART转不进去还是病毒转不进去，如果只是CART的话要考虑载体和病毒的问题，比如启动子啊，滴度，转染时机等，如果对照GFP都转不进去的话可能就是体系或者细胞的问题了

作者: 六弦七品 时间: 2016-3-30 09:41

回复 riverdtang 的帖子* t7 i) _- z( M* `8 H& \- a
4 C, E: b: s$ G+ @! Y5 R3 j0 k
我们转T细胞的同时转293T，293T是可以检测到CAR的，T细胞检测不到，现在不知道问题出在哪

作者: riverdtang 时间: 2016-3-30 09:49

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T细胞可比293T难转多了，293T只要活着、状态不差，都能转进去的，T细胞分离后转染的时机，MOI，刺激的条件都很重要，建议你还是用GFP病毒转一下T细胞，优化T细胞本身的转染效率再转CAR

作者: ET生物人 时间: 2016-3-30 13:19

慢慢发现，不同人的T细胞感染效率差异有点大！！你们做的T细胞是来自哪里？来源稳定吗？

作者: 木子小王令 时间: 2016-3-30 14:20

回复 riverdtang 的帖子) S0 O0 G& v8 h; `4 D
9 ]. L/ L- m/ o. B
你好！我是刚接触慢病毒转Tcell的实验，请问初始摸索的过程中，一般慢病毒转染Tell的时机，细胞接种量，MOI可以设定多大的梯度范围呢？我试过一次，Tell接到6孔板中是3×10^5/well，MOI为200，作用时间48h都没有换液，细胞状态还是很好，但是转染效率很低，不足10%的样子。

作者: riverdtang 时间: 2016-3-30 16:24

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T细胞分离后用抗体刺激48h转，MOI：10-50我们的转染率就很高了，50%以上吧，感染第二天换液，铺板密度10^6/ml都可以，我觉得可能还是细胞激活的问题

作者: yanxm920 时间: 2016-3-30 16:44

没有遇到过呢

作者: 木子小王令 时间: 2016-3-30 16:56

回复 riverdtang 的帖子9 b- X% ^+ b2 [& c, P
8 G" e0 ]! x+ v4 J8 e: V6 ^% e1 C# B/ O" L
是的，感觉自己还是操作有问题。1 [4 E3 g, t0 u# p2 S
是别人给的培养第九天的Tcell，我每孔取了3×105接的。因为以前慢病毒转染时候一般都是在转染时细胞汇合度达30~50%，所以这回转Tcell也想当然的沿用这个规律。4 P' u1 B w5 o; \: Q

请问你是在Tcell初始分离后就开始用抗体刺激吗？是不是这个时期的Tcell活力比较高呢？（我之前用的Tcell是不是有点老了？）* [- T) J' l% P

铺板密度如果是10^6/ml，6孔板铺1ml就可以的吧？接种第二天做转染，然后24h后再换液？

作者: riverdtang 时间: 2016-3-30 17:55

回复木子小王令的帖子# k) p9 H' k2 l7 v( E

是的，第九天转那效率肯定不会很高的，我们分离就刺激，浓度看你们所需的细胞种类和抗体质量了，这个需要摸索一下，不过你们可以长到第九天还有10%转染率，那刺激可能不是最大的问题，你可以试下分离2-3天转，可能会好些。悬浮细胞不需要铺板啊，直接转就是了，第二天换液。

作者: 木子小王令 时间: 2016-3-31 09:13

回复 riverdtang 的帖子 O( _$ s# f4 n6 X N/ j
. G/ h$ p- I) }; @# s0 ?( f
恩恩！谢谢大神！5 `* {0 v- L/ C5 L
我下次试着做个梯度，有问题还请多多指教！！！

作者: ET生物人 时间: 2016-3-31 09:35

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你们是用什么培养液的？？怎么转染率这么高，我们感染效率一直都很不稳定。

作者: 六弦七品 时间: 2016-3-31 10:16

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你们转染效率这么高，我们都用了RetroeNection加polybrene，还是没多少，应该是载体有问题，你们用的那种载体？

作者: 六弦七品 时间: 2016-3-31 10:18

回复 winqi 的帖子; j/ Y1 x# `7 J6 K" A

用的CMV，最近准备换ef-1a

作者: riverdtang 时间: 2016-4-1 10:52

回复六弦七品的帖子& B1 {2 G+ e+ D7 X

启动子试过没有什么明显的差别，还是转染时机影响吧，分离激活后尽早转会好些

作者: jinhaifeng 时间: 2019-1-11 14:06

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请问你们用聚凝胺了吗

作者: 只因偶然 时间: 2020-2-10 21:23

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你们测转染率是什么时候测的？为什么我们养的CAR-T，转染第5天后（转染第2天换液），细胞增殖速度变慢，活性下降了呢

作者: 只因偶然 时间: 2020-3-1 12:01

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0 b3 q+ J5 [3 L0 Z* j' x4 {+ c
你好，我做car-t，慢病毒感染后第5天开始细胞生长速度变慢，不知道是什么原因

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