干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 求助贴滴度检测 [打印本页]

作者: maokai345 时间: 2016-3-29 10:07 标题: 求助贴滴度检测

我包被的慢病毒目前在滴度检测，可是发现稀释10^7与10^3数目差别不大（但是亮的不是很多），重复了多个孔，都有这个现象。稀释的时候，我每个孔都吹打混匀再加入的。不知道是不是开始的滴度不够？

图片附件: 3-22 S感染48h 10^3.jpg (2016-3-29 10:05, 21.43 KB) / 下载次数 240
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NzY2NDF8NjZmMTBjZDB8MTc2ODUyMzQ5MHww

图片附件: 3-22 S感染48h 10^7.jpg (2016-3-29 10:05, 16.69 KB) / 下载次数 246
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NzY2NDJ8MDBkNGFjZDh8MTc2ODUyMzQ5MHww

作者: maokai345 时间: 2016-3-30 10:53

求助各位大神

作者: cyberpig 时间: 2016-4-8 09:16

你是感染什麼細胞？如果要感染原代或干細胞的話，一般滴度要比較高。如果是普通細胞株，10^7己經很高了。個人覺得可以考慮以下幾點：
（1)病毒有沒有保存好：病毒不能存放在四度太久，最好收完離心後立即放到－80度。而且要預先分裝，反覆凍融也會影響效率。
（2)感染時培養基的量：一般感染24小時的話，不會擔心蒸發。由於病毒是會浮的，所以用越多培養基會難細胞越遠，所以六孔板最終體積我只會用2ml左右。一般我會試100%病毒培養基或50%病毒培養基／50%新培養基。如果你濃縮了，只要加特定的量到新培養基好了
（3)有沒有用polybrene：可以考慮用5-10 ug/ml（millipore的），可以幫助病毒沉下去。但要注意會不會影響細胞的形態。7 |+ i8 @" s/ j. \" s4 L7 B$ z
（4)如果還是不行，可以用multiple infection。每24小時換一次新的病毒培養基。但要注意有沒有CPE。* }+ p$ m* n# A% |! c
（5)如果質粒帶selectable marker，就等感染後24小時開始殺，那樣應該能成功。如果沒有，你只能考慮用FACS分選出成功感染的cells。

作者: maokai345 时间: 2016-4-8 13:49

回复 cyberpig 的帖子
9 I' x x) @9 s# Q
谢谢你的回答，感谢。我的是原代细胞，我收下来就分装放到-80，用多少取多少的。我是通过离心浓缩的病毒，直接加新的培养基做的。最近几次实验添加了下polybrene（5ug/ml)，可是发现好像对细胞有伤害，细胞会死一些,复感染293就像上图一样，可是感染原代不亮（有试过每隔24h重复给毒，但是好像没什么效果）。目前来说就是浓缩下来的病毒，感染293T检测滴度时出现上图的情况，不同梯度稀释感觉亮的数目差不多。但是用浓缩的原液去侵染原代，就是不亮，一点亮都没有。

作者: cyberpig 时间: 2016-4-8 22:20

回复 maokai345 的帖子: k. k* o9 x6 o% o( Q* T
4 L9 p* e) }$ u! x2 B. V
293T理論上來說應該很容易感染，所以才用來檢測滴度。現在看來有可能是濃縮時病毒的活性受到影響。如果質粒還夠的話建議重新包裝一批，畢竟慢病毒的包裝比較快。如果不想濃縮的話，其實可以考慮收病毒時用的培養基少一點（像正常100cm培養皿用10ml，改用5ml）。一般我會在傍晚轉染，第二天早上換成5ml培養基。第三天早上收36小時後的培養基放4度，再換5ml新的培養基。第四天早上收60小時後的培養基，混合，離心，0.45um過濾和分裝。用這方法包裝的pLKO.1病毒時，我發現沒稀釋的和1:1稀釋的單次感染效率都有80%以上，只差幾％。

作者: maokai345 时间: 2016-4-9 12:19

回复 cyberpig 的帖子

恩恩，谢谢我试试看，我病毒这回就不浓缩，用5ml换液，收2次，合并之后就放4度吧，用时直接1:1（新鲜培养基）或者直接原液感染，请问你那边是用6孔板做的吧，4度最多是否存放时间是一周？那我试试，再次感谢！

作者: cyberpig 时间: 2016-4-12 14:55

回复 maokai345 的帖子

我是用10cm皿做的，如果6孔就每孔用1ml來收病毒（按比例增加減少）。4度最好不要放超過3天。

作者: maokai345 时间: 2016-4-13 23:14

恩恩，收到。实验正在进行中~

作者: maokai345 时间: 2016-5-10 08:54

回复 cyberpig 的帖子
$ y% |( {8 x" b+ H
你好，我按照你的方法，我换成5ml培养基做过2次，目前发现一旦换成5ml之后，细胞就基本不再生长了，也就是转染荧光数目也不再增加了，有点奇怪。求教。只要我用10ml的正常换液他就继续生长及发光数目也持续增加。

作者: cyberpig 时间: 2016-6-1 11:08

回复 maokai345 的帖子
2 N" V% l+ i K4 T* Y) s; R
你是說HEK嗎？如果是HEK的話沒有太大關係吧，因為只要有釋出慢病毒就好。我那時候是不帶瑩光的，所以滴度是做流式來測定的。不過我的確有觀察到HEK會掉下來和cytopathic effect很嚴重（也許因為掉的嚴重我沒留意到細胞的生長），不過我倒覺得這些是high titre的效果啦。

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)