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标题: ［求助］有关T细胞培养之问题 [打印本页]

作者: nailute1985 时间: 2016-3-30 13:58 标题: ［求助］有关T细胞培养之问题

最近在养T细胞，我们是从cord blood中提的PBMC，然后添加IL2 CD3/28的可溶性抗体刺激，IL2大概500IU／ml， CD3/28 300ng／ml 都是在D0天加的。现在有几个问题像大家请教一下：
1、现在是D5，细胞增殖很不明显，而且抱团生长十分严重，基本上我吹散了之后，过10分钟左右就又开始抱团了，这正常么？（脐带血当时没有立即处理，4度放了大概20小时左右做的实验）
2、本来一开始打算不换液，只补液的，但是从D3开始培养基发黄了但是细胞数没怎么变，我想还维持原来的细胞密度2*10^6／ml 所以我直接全量换液了，换完液之后补加了IL2，那这个时候我还需要CD3/28再刺激一下嘛？8 C8 m! b1 k4 i0 b5 C
3、D5计数，细胞数比没换液之前还少。: I d0 L8 b7 Y" c9 t/ Z
求解～

作者: 娟姐姐 时间: 2016-3-30 14:21

细胞抱团生长是正常情况

作者: nailute1985 时间: 2016-3-30 14:29

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主要是抱团太快了，是T细胞典型的特征么？我觉得其他的悬浮细胞没有这种抱团那么快的

作者: 娟姐姐 时间: 2016-3-30 14:32

轻轻拍打培养瓶就散开了，悬浮生长的细胞抱团正常

作者: nailute1985 时间: 2016-3-30 14:48

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" H. b" Z; O' _. Q6 C+ [
我都是用吹的……

作者: 醉心科研 时间: 2016-3-30 15:19

本帖最后由醉心科研于 2016-3-30 15:20 编辑

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+ q0 m8 [, |$ ^
1 接种密度偏高; @( j5 y- L/ P& H" [: M; m3 @8 ?
2 前几天不需换液，实在受不了可以补因子。
3 前7天计数没有太大参考意义。
4 补因子的时间与外周血培养不同，是因为脐血都是这样补法吗

作者: nailute1985 时间: 2016-3-30 16:30

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嗯，我也觉得2*10的6稍微有点高，下次1＊10的6就可以了。其实按说应该是补液的，但是因为前几天细胞消耗培养基太快了，但是细胞不怎么增殖，我如果再补液的话，细胞密度就下降了，我还是想维持这个密度，所以我就全量换了，然后补的IL，现在的问题就是，我全量换液之后，我的CD3/28还需不需要刺激？有一种说法是：CD3/28加完之后T细胞已经是处于激活状态了，换液之后就不需要补了，还有一种说法是CD3/28可溶性抗原需要存在于培养基中持续刺激，换液的话就需要加…这两种说法我不知道哪个对。

作者: riverdtang 时间: 2016-3-30 16:42

2*10^6已经接近生长密度上限了，调到1*10^6甚至5*10^5都可以，T细胞抱团生长很正常，不要吹散，成团有助于其分泌有利的生长因子

作者: 醉心科研 时间: 2016-3-30 17:29

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8 p; p2 }9 o* a. d, k
按外周血T细胞的培养来说，不需要持续加。

作者: nailute1985 时间: 2016-3-30 21:51

嗯嗯下次我调低点但是现在我需要计数看看生长曲线，不吹散的话我没办法计数呀，细胞数也不知道了就

作者: ET生物人 时间: 2016-3-31 09:21

有些培养基成团严重些，不过这个不是大问题，轻轻吹散一下就好。PBMC最好尽快做，20小时这么长。细胞状态不好，养着会死也正常，尽量加液，少换液。T细胞，特别感染的T细胞都比较脆弱

作者: 我是传奇 时间: 2016-3-31 09:29

细胞应是先分化后增殖，第0天就加IL-2，不太合理，另外CD3/28 的量是300对应IL-2是500 也不太合理。接种密度是2百万没问题，问题是你要每天都调整，后期放宽到1百万或50万没问题，总结一下，IL-2加的太早了，后期又不补充所以细胞没长起来。

作者: ET生物人 时间: 2016-3-31 09:38

回复我是传奇的帖子0 F2 c$ ~2 o; W* R, {

如果PBMC后分选出来的T细胞，直接加IL培养液好正常吧

作者: nailute1985 时间: 2016-3-31 09:47

回复我是传奇的帖子

这个是我们boss给的protocol，3/28加的量和Il2的量据说是验证过的，您说的我每天都需要调整是什么意思？细胞密度么？前几天细胞基本上是不增殖的，细胞数就是那么多，但是培养基消耗很快，如果我按1:1或者1:3补液的话会不会细胞密度太低了不利于T细胞的生长呢？而且IL2我一般是补液的时候按照培养基体积再补充的，不是每天都往里面加。还有，因为我们是做的CD3/28的可溶性抗体，我期间换了一次液，那我换液之后还需要再刺激一下么？

作者: 我是传奇 时间: 2016-3-31 10:10

每次补液时所补的IL-2浓度应与原液一致，若换液则需补充IL-2，其他抗体无需添加，你用的什么培养基？有加自体血浆么？

作者: 我是传奇 时间: 2016-3-31 10:10

回复 ET生物人的帖子& l2 @4 ^& J. d/ |1 e
" R4 B; H% c8 D3 ^- @
IL-2受体还没打开，加了没用。

作者: ET生物人 时间: 2016-3-31 11:16

回复我是传奇的帖子& g3 [( T" K0 k* a& G/ z/ R

请问IL-2受体是什么时候什么情况下打开的？

作者: 我是传奇 时间: 2016-3-31 11:30

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一般18-24h

作者: nailute1985 时间: 2016-3-31 12:37

回复我是传奇的帖子
& k0 Q+ @, Q4 Z
也就是说CD3/28刺激一下就可以了，不需要持续的刺激？我们没加自体血清，我们用的HSA# }' i8 a2 I8 U& y2 R

作者: 清如许231 时间: 2016-3-31 16:08

适当补点血清吧

作者: nailute1985 时间: 2016-4-1 09:28

回复清如许231 的帖子

我们用的HSA，效果可能会更好吧

作者: fenlichong 时间: 2016-4-1 10:15

一般T细胞增殖到一定密度后才会抱团，如果前期增殖慢，细胞量不多易抱团可能是因为其个体的特异性，吹散之后还是会很快抱团的，我也遇到过。楼主继续养养看吧。

作者: lyj-0017 时间: 2016-4-1 13:52

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你这个都没写有没有干扰素r，你确定没有这个因子吗0 q# P$ x% E. N2 n" i7 V* S
？

作者: nailute1985 时间: 2016-4-1 14:03

回复 lyj-0017 的帖子& O& f- [0 o! v; f9 Z( z

T细胞扩增不需要干扰素的

作者: lyj-0017 时间: 2016-4-1 16:24

回复 nailute1985 的帖子+ ^% H) C- ]! d+ q) Z$ K. R
+ b* |- U! \1 N V
那你就再摸索摸索吧，呵呵。。。

作者: 魏夏媛 时间: 2016-4-6 10:22

培养基黄了之后可以半换液，并提高血清的量，看看效果怎么样

作者: 随时准备下线 时间: 2016-6-24 10:53

可以试试包被贴壁刺激的方式，那样细胞基本不成团，便于计数。

作者: chenguangyu 时间: 2016-6-24 16:39

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CD3/28后面不用再刺激了.

作者: skytrack 时间: 2016-6-28 13:51

我们这边做的是TIL细胞，常规做，是这样的养的：1、IL2我们这边是直接加3000U；2、CD3/28我们用过，1/100的加，刺激后长得很快，但是还是觉得辐照的100倍PBMC是最好用的。另外要注意的是最好少动，半量换液。

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