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标题:
测序问题？
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作者:
gxbzjznn
时间:
2016-4-7 15:33
标题:
测序问题？
大家好，最近在做分子实验，设计引物P基因，PCR结束将未纯化的PCR产物送去测序（50ul体系，自带10ul上、下游引物，单向测序），但是测序结果出来的序列大小跟我设计引物P出来的目的片段大小不一致！比如，有个基因，设计引物和pcr产物片段大小都是102bp,但是测序只有59bp，之后将测得的序列到NCBI上进行序列比对，结果跟我设计引物参照的序列也比对上了（58/59）。请问这种结果真实可信吗？能够放在论文附录里面吗！？
作者:
wuhuaguo88l
时间:
2016-4-8 08:09
按某公司的送样要求：未纯化的PCR产物，1片段大于150bp；2提供30-50μlPCR产物（20ng/μl，总量大于600ng），若取3μl样品，应能清晰的分辨出目的条带，你能确定你的样本能符合这些要求吗？
作者:
gxbzjznn
时间:
2016-4-8 08:55
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wuhuaguo88l
的帖子
0 s' Z. n) {! e$ d- r
! b& }0 E: W0 f
除了1不符合，其他均符合！因为是做定量试验。所以目的片段都不大！
作者:
watchen198891
时间:
2016-4-8 08:58
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gxbzjznn
的帖子
$ j+ o" U- C, Z8 }* s
$ x" X* D5 C0 }+ B# u8 j# s
一般测序前面的一段都是不正确的，所以你单独拿100bp长度的DNA去测序可能有点不太准确，为了确保正确最好连接在T载体上再去测序，估计这样要可靠一些。
; X3 k) W0 U* E: V8 u5 a
作者:
gxbzjznn
时间:
2016-4-8 09:03
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watchen198891
的帖子
, r3 l, Y' S1 g/ b5 L3 f/ ^7 S
! c% m0 G& Q! l& V9 R& c0 \+ g' N( t
但是拿到的这个短片段59bp测序结果去ncbi上比对也能跟我需要比对的目的序列比中
作者:
gxbzjznn
时间:
2016-4-8 09:04
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watchen198891
的帖子
, [3 Q8 |8 F3 H' @
* h. N" V5 u7 i& B9 Z9 r: c$ g7 U l- G
请问这个比对结果说服力强吗？可以用吗？因为不想连载体做克隆了
作者:
春玲子
时间:
2016-4-8 09:29
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gxbzjznn
的帖子
. s6 ?7 |8 B7 a$ y4 p3 }5 R$ b
5 H! P4 m; E' J) M) W. k
你扩增出来的基因不是你的目的基因，结果不可靠。
作者:
watchen198891
时间:
2016-4-8 12:39
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gxbzjznn
的帖子
+ t' K# r% [) h- i$ x
2 R3 \; j# O+ T- V% S
不具备说服力，测序结果中正确的序列太短。
作者:
gxbzjznn
时间:
2016-4-8 16:00
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春玲子
的帖子
/ v* u" I* w0 v9 E* ~* _
' R! V1 Y$ P0 Y0 l: g
怎么讲？
作者:
gxbzjznn
时间:
2016-4-8 16:00
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watchen198891
的帖子
/ p$ \9 q. U- E- F i
, Y/ ?& ]( f2 d4 {
太短？
作者:
gxbzjznn
时间:
2016-4-8 16:12
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春玲子
的帖子
0 }! M% v {7 c K0 i/ t( r: {
, d+ h( ?4 G$ q0 d4 O
看看这个
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44.jpg
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http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NzY5MTR8YzgxMmE2ODB8MTc0OTAxMzc2OXww
作者:
gxbzjznn
时间:
2016-4-8 16:14
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春玲子
的帖子
; X- C/ V/ m. U$ }# x+ X9 a$ v
" L9 w( u& Z( \; r4 D9 I
我觉得克隆后测序结果没有PCR产物直接测序可靠。而且非常确定。但出处我忘了。PCR会有错配，如果直接PCR产物测序时正确的扩增会掩盖错配，因为错配的比例一定不会大于正确的延伸。如果是对PCR产物克隆，事实上只是测的数百万条扩增产物的一条，存在一定的可能将错配的产物连到载体上，具体比例跟错配发生的时间有关，错配在PCR早期那么克隆到错配序列的比例就高，反之低一些。
作者:
gxbzjznn
时间:
2016-4-8 16:14
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watchen198891
的帖子
7 w4 o/ u% G2 t) E
5 r, Z' A0 B9 M, B9 K3 K
我觉得克隆后测序结果没有PCR产物直接测序可靠。而且非常确定。但出处我忘了。PCR会有错配，如果直接PCR产物测序时正确的扩增会掩盖错配，因为错配的比例一定不会大于正确的延伸。如果是对PCR产物克隆，事实上只是测的数百万条扩增产物的一条，存在一定的可能将错配的产物连到载体上，具体比例跟错配发生的时间有关，错配在PCR早期那么克隆到错配序列的比例就高，反之低一些。
作者:
春玲子
时间:
2016-4-8 16:32
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gxbzjznn
的帖子
! I- |9 i: e c0 u
z) C% a9 ]$ O# q
引物的片段也不太对
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