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标题: 定量试验扩增曲线? [打印本页]

作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-11 18:03 标题: 定量试验扩增曲线?

同一个基因做了两次定量试验，但扩增曲线为什么差别这么大？哪个好？

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作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-11 18:06

这是第一做的（用的SYBR酶）

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作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-11 18:08

这是第二次做的用的2X Realtime PCR Master Mix做的

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作者: wuhuaguo88l 时间: 2016-4-11 19:16

用染料法做QPCR，需要看溶解曲线，你是绝对定量还是相对定量，实验目的是确定基因的拷贝数还是表达量，没有交代清楚

作者: sithbj 时间: 2016-4-11 19:52

同上，对照那???

作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-11 20:41

回复 wuhuaguo88l 的帖子& e, v. y0 n" D/ n; v" ?0 k
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相对定量看基因表达量内参和溶解曲线没放上来

作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-11 20:43

回复 sithbj 的帖子: V) r2 Y2 g1 G5 g- Z% B( D

相对定量看基因表达量内参和溶解曲线没放上来我主要想问的是单独从扩增曲线能否看出来扩增效果的好坏？因为试剂商跟我说的是2X Realtime PCR Master Mix是他们从美国哈佛大学实验室分装过来的，效果非常好。。。

作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-11 20:46

这是第一次做的熔解曲线

作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-11 20:48

回复 gxbzjznn 的帖子3 F' @4 Z6 F' P+ W8 g

这是第一次做的溶解曲线第二次做因为是新的试剂（2X) 由于说明书没看明白可能程序设置错了只跑出来扩增曲线没跑出来溶解曲线

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作者: sithbj 时间: 2016-4-12 10:02

首先2X的效率低了好多数量级。如果条件类似的话，这是一个失败的反应。实验中可能有一个致命的错误。首先2X，是最后加完引物，样本和水后，正好是1X。其次别忘了引物。第三，这个Dye是什麽，波长要对应。) O$ I' b7 W/ s9 z

英雄重来一遍吧3 P( C9 S" O+ h% r

作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-12 10:41

回复 sithbj 的帖子4 p4 F5 Y1 y! C" u0 v2 S  x
  H0 G0 r+ n: }8 o5 t0 ?- f
逐个回答你的问题：1.条件确定类似（cDNA浓度几乎一致都是按照定量试验要求的在100-200ng/ul、反应体系以及加样顺序全部一致)。 2.引物确定加了的（两次实验用的同一管引物） 3.2X里面的荧光染料也是SYBR GreenI  但是你说的我还是不明白，求指点。。。。

作者: wuhuaguo88l 时间: 2016-4-12 10:46

溶解曲线还不错，引物应该还可以。如果是扩增曲线感觉不好，有问题的话，可以将样本10倍往下稀释成3-4个梯度，然后做QPCR，类似于绝对定量，看一下扩增效率怎么样，内参也要用相同方法测一下，若是扩增效率在1.9-2.1之间，实验结果是可信的。

作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-12 11:35

回复 wuhuaguo88l 的帖子
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扩增效率怎么计算的？

作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-12 11:41

回复 wuhuaguo88l 的帖子; o* g* q9 j2 h( M; J4 R
* U% k9 Y. ~5 w* n7 y
我们实验室用的罗氏的仪器，计算出来的扩增效率都是在90%-120%之间，都是用百分比表示的。您说的这个1.9-2.1也是用罗氏的仪器做的吗？

作者: wuhuaguo88l 时间: 2016-4-12 12:45

罗氏LC96或LC480只要看一下标准曲线就可以了，我和你其实是一个意思，理论上扩增是2的n次方，实际实验是（1+e）的n次方，e是扩增效率，应该在90%-120%之间是可信的

作者: gxbzjznn 时间: 2016-4-12 15:33

回复 wuhuaguo88l 的帖子0 D& x$ w5 q4 R

对啊已经根据公式计算过了 80-120%之间都是有效扩增 90-105%是优化扩增我们的这个扩增效率都是在90-105%没有问题而且标准曲线的回归系数都是大于0.99 就是不知道问题出在哪里了

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