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标题: 定量试验扩增曲线? [打印本页]

作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-11 18:03     标题: 定量试验扩增曲线?

同一个基因做了两次定量试验,但扩增曲线为什么差别这么大?哪个好?

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作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-11 18:06

这是第一做的(用的SYBR酶)

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作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-11 18:08

这是第二次做的 用的2X Realtime PCR Master Mix做的

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作者: wuhuaguo88l    时间: 2016-4-11 19:16

用染料法做QPCR,需要看溶解曲线,你是绝对定量还是相对定量,实验目的是确定基因的拷贝数还是表达量,没有交代清楚
作者: sithbj    时间: 2016-4-11 19:52

同上,对照那???
作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-11 20:41

回复 wuhuaguo88l 的帖子& e, v. y0 n" D/ n; v" ?0 k
  S3 t. s, m0 Q; P" b
相对定量  看基因表达量  内参和溶解曲线没放上来
作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-11 20:43

回复 sithbj 的帖子: V) r2 Y2 g1 G5 g- Z% B( D

/ f( P* C( k" T5 W' J; m2 m: k8 X0 H, t相对定量  看基因表达量  内参和溶解曲线没放上来  我主要想问的是单独从扩增曲线能否看出来扩增效果的好坏?因为试剂商跟我说的是2X Realtime PCR Master Mix是他们从美国哈佛大学实验室分装过来的,效果非常好。。。
作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-11 20:46

这是第一次做的熔解曲线
作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-11 20:48

回复 gxbzjznn 的帖子3 F' @4 Z6 F' P+ W8 g

* n4 ^3 J2 ]+ T: A这是第一次做的溶解曲线 第二次做因为是新的试剂(2X) 由于说明书没看明白 可能程序设置错了 只跑出来扩增曲线 没跑出来溶解曲线

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作者: sithbj    时间: 2016-4-12 10:02

首先2X的效率低了好多数量级。如果条件类似的话,这是一个失败的反应。实验中可能有一个致命的错误。首先2X,是最后加完引物,样本和水后,正好是1X。其次别忘了引物。第三,这个Dye是什麽,波长要对应。) O$ I' b7 W/ s9 z

8 _! ~. F' {2 Y4 X! ^* T/ |- ]$ n英雄重来一遍吧3 P( C9 S" O+ h% r

作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-12 10:41

回复 sithbj 的帖子4 p4 F5 Y1 y! C" u0 v2 S  x
  H0 G0 r+ n: }8 o5 t0 ?- f
逐个回答你的问题:1.条件确定类似(cDNA浓度几乎一致都是按照定量试验要求的在100-200ng/ul、反应体系以及加样顺序全部一致)。 2.引物确定加了的(两次实验用的同一管引物) 3.2X里面的荧光染料也是SYBR GreenI  但是你说的我还是不明白,求指点。。。。
作者: wuhuaguo88l    时间: 2016-4-12 10:46

溶解曲线还不错,引物应该还可以。如果是扩增曲线感觉不好,有问题的话,可以将样本10倍往下稀释成3-4个梯度,然后做QPCR,类似于绝对定量,看一下扩增效率怎么样,内参也要用相同方法测一下,若是扩增效率在1.9-2.1之间,实验结果是可信的。
作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-12 11:35

回复 wuhuaguo88l 的帖子
- P9 w8 e( B4 Z/ [4 m' {4 X2 t7 m0 O4 [! s
扩增效率怎么计算的?
作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-12 11:41

回复 wuhuaguo88l 的帖子; o* g* q9 j2 h( M; J4 R
* U% k9 Y. ~5 w* n7 y
我们实验室用的罗氏的仪器,计算出来的扩增效率都是在90%-120%之间,都是用百分比表示的。您说的这个1.9-2.1也是用罗氏的仪器做的吗?
作者: wuhuaguo88l    时间: 2016-4-12 12:45

罗氏LC96或LC480只要看一下标准曲线就可以了,我和你其实是一个意思,理论上扩增是2的n次方,实际实验是(1+e)的n次方,e是扩增效率,应该在90%-120%之间是可信的
作者: gxbzjznn    时间: 2016-4-12 15:33

回复 wuhuaguo88l 的帖子0 D& x$ w5 q4 R

* n6 j$ _9 ?( @对啊 已经根据公式计算过了 80-120%之间都是有效扩增 90-105%是优化扩增 我们的这个扩增效率都是在90-105%没有问题 而且标准曲线的回归系数都是大于0.99  就是不知道问题出在哪里了




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