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标题: 如何分选Treg细胞？ [打印本页]

作者: 842195369 时间: 2016-5-18 15:37 标题: 如何分选Treg细胞？

具体方法，详细点的

作者: veda327 时间: 2016-5-18 16:53

T细胞分选，方法无外乎两种，流式分选和磁珠分选，两种方法都要用到分子标记，对应的产品分别是有关分子标记的流式抗体和抗体标记的磁珠。 x9 ]) C G7 \/ [
根据你要分选的细胞量，选择合适的方法，这个论坛里面两种方法的优劣都讨论过，然后买好标记好的抗体，根据说明书来操作即可！
具体到Treg细胞，一般用CD4＋CD25+来进行分选，我知道的某美有磁珠分选的试剂盒，第一步的阴选得到CD4+ T细胞还比较多，但第二步CD4+CD25+的细胞得率非常非常低，所以分选之前最好进行适当条件的扩展，以提高最后的的率！, ]9 d% \% p9 Q2 R
另外的方法：1. 7*107个PBMC，首先用磁珠分选CD3+CD4+的细胞，然后用BD的aria机器分选CD3+CD4+CD25+CD127low，能得到大约一百万个细胞；& c5 w6 i6 w7 P4 N! m8 S0 o
2.流式分选：流式FITC-CD4和PE-CD25分选，

作者: 842195369 时间: 2016-5-19 09:38

回复 veda327 的帖子8 f; C( L# j, O) O$ ?9 C
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谢谢

作者: 842195369 时间: 2016-5-19 13:57

磁珠抗体分选获得CD4+CD25+T细胞方法：9 q- x- _* i8 d. t9 B6 I
取1×107个细胞量，用含0.5% BSA，2mM EDTA的PBS(buffer液)重悬，加入适量的生物素标记的鸡尾酒抗体(Biotin-Antibody Cocktail)，混匀，4℃避光孵育10min，再加入适量抗生物标记的磁珠(Anti-Biotin MicroBeads)和CD25-PE抗体，混匀，4℃避光孵育15 min，用buffer洗涤后1000 rpm离心10 min，弃上清液，沉淀用500 μl buffer重悬，置LD分离柱于MidiMACS分选器中，l ml缓冲液冲洗LD分离柱2次后，将细胞悬液加入分离柱中，收获从分选柱中流出的细胞即为CD4+T细胞。将收集到的CD4+ T细胞混悬液1000 rpm离心10 min，弃上清液，沉淀用buffer重悬后加入适量的抗CD25-PE磁珠，混匀，4℃避光孵育15 min，用buffer洗涤后1000 rpm离心10 min，弃上清液，沉淀用500 μl buffer重悬，置MS分离柱于MidiMACS分选器中，l ml缓冲液冲洗MS分离柱2次后，将细胞悬液加入分离柱中过柱，再用buffer过柱直至流出液清亮不含细胞，将柱子移离分选器后，收集柱中细胞即为CD4+CD25+ T细胞

作者: fenlichong 时间: 2016-6-7 17:23

使用免疫磁珠和流式分选技术的较多，但磁珠不适合分离高纯度Treg产品；流式细胞术可分离高纯度的Treg，但无菌操作困难；目前的分选方法还有微流控芯片技术，为无菌制备提供了另一种选择，且没有液滴和相关气溶胶产生，但使用者很小众。

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