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首先我们来聊聊修饰方面方面的整合问题。是否进行整合型修饰以及整合位点选择，要与修饰前所选择的T细胞类群、所治疗的肿瘤类型及选择的TAA特异性高低进行权衡，因为整合位点选择不当或非整合性修饰而导致的CAR丢失，将导致CAR-T过早失去功能，这对于较顽固的肿瘤治疗不利；而整合型修饰结合修饰前T细胞亚群选择导致记忆性CAR-T的形成，这在一方面能够有效防止复发，但是这仅仅限于选择的TAA/TSA特异性较高的情况下才有利，否则将导致副作用的长期存在，如针对B细胞白血病一类的CD19-CAR-T，形成记忆性CAR-T长期存在于患者体内将极大地不利于患者的健康，因为这将导致患者长期的B细胞发育不健全，而这一情况还是比较好的，如果是针对实体瘤的TAA，如果该TAA在正常组织或者器官表达，将长期存留发生严重副作用的可能。/ Y J4 g+ I; c0 N+ N- f" Z8 D# `
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另外，整合型修饰中整合位点是否导致突变产生，从而导致修饰后T细胞出现坏死、失能等，都是需要解决的问题，所以在整合修饰载体的插入位点方面，需要进行一定研究，最好能够使其定点整合，而对于选择靶点特异性不高的肿瘤进行治疗时，应考虑进行瞬时转染、少量多次治疗。另外，在CRISPER/cas9或者TALEN技术结合应用的情况下，可考虑进行通用型CAR-TZ制备中TCR定点敲除的同时加入特定位点，后期进行CAR的定点嵌入修饰。 & L0 r) T6 g, x3 Y* @& R5 S7 d8 O 3 i% P3 l* e5 p* U5 g. ~9 N 7 T, ^7 U! c- P& V然后，再来谈谈关于修饰过程中对T细胞的损伤问题。对于慢病毒载体、逆转录病毒载体等，转染时对T细胞的损伤较电穿孔载体轻，这也在一定程度上取决于病毒类载体结构设计、制备方法、转染前T细胞状态等，而电穿孔载体对于T细胞的损伤是无法避免的，唯一能做的就是想办法将其降到最低，这方面可以根据载体大小、T细胞状态等情况优化电转条件，载体中添加入核引导序列、根据不同T细胞亚群改进PB/SB载体结构等。这方面，笔者所在团队设计的新型电穿孔载体结合优化后的电转条件，将有望能够很好地降低损伤和提高修饰效率问题。 / u* _3 \# j' z* M- h 7 A( z) f! x- ` p( Y7 x/ v5 J1 f& _ {
修饰效率方面的问题，在添加特异性修饰筛选标签或者结合CAR特异性磁珠筛选富集，后期进行CAR特异性刺激激活和增殖，在修饰前分选并短期激活的T细胞量达到108的情况下，则只需要修饰效率达到30%以上即可满足要求。当然，为了实现短期制备细胞要求，在后期特异性诱导增殖方面尽量缩短时间，达到6-8天制备得到临床需求量和状态，则需要将修饰效率提高至50%以上。 ' C0 D: y- `2 E) z' o" M. E* O0 `" C
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4、T细胞修饰前细胞亚群的选择问题* j6 ]' m A. @4 \; P1 N$ o
# r( {7 e) J8 I8 `/ ^$ i/ I. Y; U 9 d b: j4 _. b* b9 m) H+ V3 k+ Y基因修饰前细胞亚群的选择问题，直接决定了后续治疗效果的差异，单纯选择CD4+T细胞或者CD8+T细胞都不能提供有效地杀伤，而直接对PBMC进行修饰，将同时对其中的Treg细胞等发挥抑制性作用的细胞进行CAR修饰，这对于实体瘤的治疗是不利的。所以在基因修饰前进行的T细胞分选中，需要进行优化选择合适的细胞亚群比例，以及优化分选手段降低对细胞的损伤。在CAR-T针对实体瘤的治疗中，由于实体瘤庞大的细胞数量和免疫抑制情况，修饰前细胞亚群选择这一方面，还需要根据针对不同癌种和不同修饰载体、TAA特异性高低等情况进行进一步摸索和优化。0 Q) G7 n3 n2 t" \' Y9 G" o
$ Q8 C2 b' n0 ]) Q * k( ?- V3 A. W! ~5、CAR-T细胞的培养和分选问题 6 c2 c4 x6 U* v e ( F6 x$ B1 I( C$ A k+ P1 F# ~9 c: i4 i+ x6 B' l8 z
如何进行对CAR-T细胞经过基因修饰之后的进一步激活和培养，将对其回输后的疗效产生显著影响。而如果采用与普通的CIK细胞刺激培养方法一样的方法，将导致CD3/CD28集簇按照T细胞本来方式形成，以及以本方式激活之后导致抑制性受体的调高表达，从而导致CAR结构无法在回输后有效形成免疫效应结构，进而影响治疗效果。所以，单独对CAR的激活和后期采用对CAR的分选，将显著影响CAR-T的疗效。这一问题，目前还需要进行更多研究和观察，因为很多开发者进行的该方面工作并不能保证CAR的有效修饰和培养激活，所以目前得到的临床试验结果以及正在进行的临床试验，还不能够深入到这一块对临床效果影响方面的研究。另外，分选方法方面，如何有效降低对CAR-T细胞的损伤也是至关重要的。 , s N" A8 t7 \4 c V$ a; N# k$ H8 a9 m% w+ U0 V; `: @# ?
6、实体瘤免疫抑制问题$ i/ f/ ?) g. ^" ?9 m: \7 i* v
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实体瘤由于其具有的免疫抑制微环境、瘤体聚集紧密等原因导致免疫细胞治疗对其疗效不佳，目前CAR-T也面临同样的问题。我们可以采用PD-1/PD-L1抗体和CTLA-4抗体，将其与CAR-T协同进行治疗，但是这样的治疗还是会受限于这一类免疫检查点抑制剂的部分系统性副反应。这方面，目前有研究者尝试采用CAR-T同时携带胞内表达抗PD-1/PD-L1抗体，突破实体瘤免疫抑制的同时降低副反应，但这样的手段需要开发一种较高效的基因表达载体和表达调控策略。) Q# o& A. C3 k- e
! v7 h. \9 ?) T' v0 g 3 E# [8 _ f4 ]! Y可喜的是，上海细胞治疗工程技术研究中心集团正在尝试进行这一方法的产业化工作，并取得了较好的初步临床试验效果。而除了这些检查点导致的免疫抑制外，肿瘤微环境中还有的IDO、肿瘤低氧酸性微环境特征、糖代谢竞争等，都是免疫限制因素，这些方面综合起来，都需要开发一些相应的方法进行进一步的CAR-T自身的调控或者与相关制剂的协同治疗。这方面，笔者所在团队正在开发的新型实体瘤特异性CAR结构，将有望能够依靠新型CAR结构内部特殊的信号结构而突破T细胞免疫抑制信号的胞内传递，以及突破实体瘤有氧糖酵解导致微环境缺乏葡萄糖而导致CAR-T细胞免疫信号传递失能问题。 % E' @6 p! T' `2 T7 p5 e4 A( [( y$ j& n% p# Q
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另外，大多数实体瘤，如胰腺癌、肝癌、胃癌等，与血液系统肿瘤相比，都具有瘤体聚集紧密、内部血管深入不足等问题，这导致CAR-T细胞无法有效趋化至肿瘤灶、无法深入瘤体内部以及瘤体内失能等问题，这方面需要进一步研究策略予以解决。 - M9 H( Z& u- S5 p' G+ T5 z1 [5 k0 `( |# A
8 ~1 C2 ~- r% F1 T7、复发问题 6 J$ F8 f0 \8 o( L. s, ]: K8 O 9 x$ o( f8 y: R8 }% y0 u6 _! m* a/ H* H! @
虽然CAR-T在血液系统B系白血病方面应用，能够有效清除肿瘤细胞，但是随着CAR-T细胞在血液中的衰亡、CAR丢失或靶抗原突变等原因，其中也有许多患者在肿瘤清除后一段时间后出现复发，所以这一问题是不得不面对的。现在，根据不同的复发情况，一般采用的方法是继续回输、结合放化疗或者靶抗原更换。 9 f7 Y3 I% p3 t" _' b `! M o4 ?/ N7 {; p4 o! [/ t