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标题: 脐带分离间充质干细胞的问题 [打印本页]

作者: kangjian1009111 时间: 2016-7-8 09:35 标题: 脐带分离间充质干细胞的问题

本帖最后由细胞海洋于 2016-7-8 15:36 编辑 k3 G. X' N, B5 u' S0 u2 p' D4 }

最近分了一根脐带，用胶原酶II和胰蛋白酶共同消化的方法分离的，酶消化后滤除组织块的滤液离心后不见有细胞沉淀，但有很多絮状物离心也离心不下来，将这些絮状物接种到培养瓶中，镜下看絮状物里有裹住的细胞，接种当天看不到有细胞，第二天镜下看到许多未贴壁细胞，三天后镜下看仍没有细胞贴壁且悬浮细胞增多，5天后镜下看仍没有细胞贴壁且部分细胞已经破壁，请问这个絮状物是什么？絮状物里裹住的细胞是不是MSC，如果是为什么没有贴壁？请教大家帮我解释一下，谢谢各位。

作者: yingfeixiang 时间: 2016-7-8 09:38

没做过酶消化法的制备，一直都是组织分离法

作者: snowny007 时间: 2016-7-8 09:54

我消化做的不多，根据自己浅薄的经验判断，絮状物应是消化未完全的组织，不知你血管是否剥离干净，或者是自己剪碎后的组织剩余，也有细胞聚团的可能性。没上图，不知道絮状物的大小，想去除可以用刮刀或直接吸出，损失些细胞是没关系的。我做的时候将脐带剥离后剪碎，胰酶先消化，再用胶原酶长时间消化，消化结果还可以，前几天镜下细胞不易观察，但要坚持换液，过几天可以正常传代了。

作者: pengxuleo 时间: 2016-7-8 10:10

这个絮状的可能是消化产生的细胞破碎造成的DNA外泄，DNA有粘性造成的。可以通过减少消化时间或者添加ＤＮＡ酶来去掉絮状沉淀

作者: kangjian1009111 时间: 2016-7-8 10:14

回复 snowny007 的帖子. q S- h) E& W
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我是先胶原酶再胰酶，这样有影响吗 }% j3 {6 d7 m) s- b+ D6 g

作者: kangjian1009111 时间: 2016-7-8 10:15

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我的细胞感觉都是包裹在絮状物里的，如果把絮状物吸走了估计就没有细胞了

作者: 随时准备下线 时间: 2016-7-8 10:58

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如果是细胞包裹在絮状物里，直接弄出来贴壁，不就可以了？我觉得应该不会是絮状物里包裹的间充质，这东西不会有选择性的，最多里面掺杂着少量的细胞。酶消化法，对酶、温度和时间的把控非常重要，最好多摸索几次，确定可靠的SOP。

作者: 鸵鸵 时间: 2016-7-8 13:59

之前也试过酶消化法，觉得消化时间和状态应该多试几次，每个实验室条件也不一样，但消化时间过长，会导致细胞死掉没有贴壁，絮状物有可能就是细胞破碎造成的粘连

作者: 谈谈 时间: 2016-7-8 14:16

温度时间都要控制好，时间过长容易导致细胞消化过度。

作者: 随时准备下线 时间: 2016-7-8 14:17

题目中的应该是间充质干细胞，不是间充值干细胞

作者: bin 时间: 2016-7-8 14:42

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我做过很多例脐带间充质干细胞制备，根据你的形容，基本上可以确定有三个问题，第一，接种的悬液中细胞量很少，第二，絮状物里面包裹的是细胞，絮状物极可能是DNA外泄造成的，第三，5天没有细胞贴壁，你的这次制备肯定是不成功的。一般来说酶消化比组织贴壁细胞得率更高，而且活率也很好，我做酶消化，10ml组织的量接种15cm培养皿，一周可以收集细胞了。

作者: bin 时间: 2016-7-8 14:44

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脐带细胞培养和制备我已经做的很成熟了，细节方面可以慢慢探讨。

作者: 细胞海洋 时间: 2016-7-8 15:37

脐带间充质干细胞聚团，形成一大片絮状物，大家有没有遇见过，求解？？？
http://www.stemcell8.cn/thread-71837-1-1.html
脐带间充质干细胞聚团，形成一大片和水母似得絮状物，检测了支原体也没污染，求解？？% }% p( H8 \3 W( m" g7 g
http://www.stemcell8.cn/thread-71836-1-1.html

作者: kangjian1009111 时间: 2016-7-19 09:25

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你好，我在16日的时候又分离了一根脐带，这次延长了消化时间，但到今天为止仍然没看到有贴壁细胞，这次没有絮状物包裹细胞。请教是哪里出现了问题？

作者: kangjian1009111 时间: 2016-7-19 09:32

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从分离到现在已经三天了，我需不需要更换培养基呢？如果换的话会不会损失一些细胞？还有就是我感觉我分的细胞里面红细胞比较多，血管要如何才能剔除干净，尤其是两个动脉血管？请指教一下，谢谢！

作者: 细胞海洋 时间: 2016-7-20 11:07

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作者: 2357710447 时间: 2016-7-20 16:16

我们都是用分离法直接分理处的华通氏胶来培养如果你要用酶来消化那样可能有点复杂我做过胎盘的羊膜细胞消化是放在恒温振荡器上面37摄氏度震荡消化时间大约一个小时过滤后培养贴壁的细胞还是很多的但是死细胞是活细胞的好多个倍需要第二天全换液出去希望对你有帮助

作者: Dunncao 时间: 2016-7-20 16:36

你好。消化法的话，是直接整根剪碎消化吗？这样羊膜、血管、胶原之类的消化不完全而呈絮状就很正常了。
为什么一定要用消化呢，直接分离华通胶剪碎培养就可以了呀，首次贴壁是比较困难，我做的普遍在一周以上能观察到克隆团，但成功率基本是有保障的。
如果一定要消化的话，也建议取华通胶消化。酶浓度和时间也要把握好。

作者: bin 时间: 2016-8-9 09:02

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很可能是细胞没有离下来，脐带组织消化后一定要用pbs或者生理盐水稀释足够多的倍数，不然液体很粘稠，不好过筛网，也不好离心。我的经验是稀释到组织体积的10倍以上，然后2000转离10分钟，再用dmem清洗一遍就好了。

作者: bin 时间: 2016-8-9 09:06

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当然了，消化时间不能太长，控制在2小时以内是比较合适的。至于你说的换液，我想说三天后如果没有贴壁的细胞你绝对养不活，干脆不要，留下贴壁的。脐带细胞活性很高，条件适宜的情况下会生长很快的。剥离血管是技术活，我这里没法和你说清楚的，我都是手把手教别人，不过给你一个思路，不需要先剥血管，也可以直接从脐带组织中把华通胶撕下来，剩余的就是血管组织和表皮，直接扔掉就好了。

作者: zhoushuiguan123 时间: 2016-8-9 10:05

酶消化法只是简单把脐带表面内皮细胞和一些絮状物消化下来，建议组织贴壁法效果不错

作者: 晗晗 时间: 2016-8-9 13:22

我们都是用组织块法进行处理的,很少用酶消化法,这种方法比较难弄,需要注意的比较多,你这样可能是因为消化的时间拉,还有酶的浓度拉都有可能,还有你这些细胞应该就是死细胞了

作者: 蒙牛一头牛 时间: 2016-8-16 09:08

建议消化后，用100目或者200目滤网过滤，然后离心取细胞沉淀，接种于细胞培养皿培养。3 l2 h# J! m" {1 g) r; Z
这样既能去除大颗粒未消化组织块，同时保证细胞纯度，有利于细胞快速贴壁生长。

作者: echizne 时间: 2016-8-30 10:46

相对于酶消化和组织块培养法，我更倾向于后者，成本低且成功率高。可以参考下

作者: 独自等待 时间: 2016-9-6 11:12

咋不用组织块贴壁法呢，现在很少有人用消化法了

作者: ltickp 时间: 2016-10-22 23:51

絮状物为未消化完成的组织和纤维，可能包含有MSC，一般而言24h内会有MSC贴壁；刚培养养时培养基内会有很多血细胞和组织等杂质，慢慢会有MSC爬出来贴壁生长，尤其是未消化完全的组织旁边较多，有可能周围一圈都是，而且分布极不均匀，一般24h内就可以看到了，过两三天血细胞会死掉，MSC就会好观察一点，培养皿中那种大个的圆的细胞有可能也是MSC，是那种要分裂或者已经分裂而未贴壁的细胞

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