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标题: 求助各位亲，PBMC分离出来红细胞过多，如何再尽量PBMC损失最少的情况下减少红细胞呢？ [打印本页]

作者: stella2015 时间: 2016-8-30 10:35 标题: 求助各位亲，PBMC分离出来红细胞过多，如何再尽量PBMC损失最少的情况下减少红细胞呢？

各位亲友们，求助一下，有没有其他相对好的办法使得PBMC损失最少，而红细胞能尽量清除掉，不影响PBMC的培养，红细胞裂解液是一个方法，有使用过的亲能推荐一下好的品牌吗？？谢谢！~~~~

作者: nailute1985 时间: 2016-8-30 13:28

回复 stella2015 的帖子
v0 M! E6 X( M; N
GE life science的ficoll分离效果不错，但是就是贵。

作者: biluolinyu 时间: 2016-8-30 13:50

ge的ficoll效果确实很好! F* ]5 D& s; b; ]9 k z
ficoll分离的时候一定要注意离心条件，离心条件的差别会影响分离效果

作者: LVXUEYAN1101 时间: 2016-8-30 15:59

PBMC分离的时候FICOLL和离心条件很重要。首先FICOLL品牌很重要，其次使用之前最好室温预热；离心的时候升降速一定要调节好

作者: 拉二胡的拉尔夫 时间: 2016-8-30 16:11

1.采血以后，一定要用生理盐水充分稀释。
2.注意ficoll的离心转速，降速一定要慢。
3.吸白膜层的时候一定小心不要插入过深。8 r+ _" Y& ]$ K4 D# M
4.以上都不行可以试试磁珠分选。
5.其实有点红细胞问题不大，有文章还报道过，红细胞还能促进免疫细胞成熟和增殖。

作者: zhouweixing000 时间: 2016-8-30 16:36

首先一点你实验室要有一套成熟的实验方案，
再有就是把每一步的试剂特性把握好，. E$ P8 m" d: j( h1 A
再有就是个人的操作水平了，- ~' k# Q7 x# d6 j7 Y8 g) D& t
在一个试验中这三点你要都做好了，+ w7 k; Y0 x2 S
实验结果自然就比较理想了。

作者: 生物太次郎87 时间: 2016-8-31 09:48

①样品质量。血液样品要新鲜，有一点点凝血分离出的效果就不太好。②分离液的质量。我们公司淋巴细胞分离液都是自己配的，分离效果不太好。一般都是分离2次，第一次用50ml离心管（装20ml分离液）。第二次用15ml离心管（装5ml分离液）。③离心条件。条件不合适，白细胞损失就比较多。其实红细胞多也没事，我养悬浮细胞，红细胞多，连红细胞裂解液都不用，哈哈，直接传代到100ml体积时，半量换液，之后越来越好养了。有需要交流，可进一步讨论。

作者: Liyun65 时间: 2016-9-5 09:44

小心操作还是很好分离的，有少量的红细胞应该是没有关系的。
要分离的血液要新鲜，放置几分钟到室温。分离液也要提前从冰箱拿出来，放置到室温。还要注意分离液和血液的比例。加入血液时注意分层界面要清晰。离心注意缓升缓降就好。

作者: 伊诺强 时间: 2016-9-5 15:27

几个注意点：一、ficoll管使用前离心；# J9 d8 x) Q: E
         二、血液到了后需混匀，再轻轻地转移到ficoll上，一定要轻！每管的血液添加量不要过多，一般不要超过ficoll量，或者更少；
         三、如遇到已有溶血现象，可用生理盐水或PBS二倍稀释后再转至ficoll上；( Q2 J: ~6 Y" y
         四、提取PBMC时一定要稳、准、狠，争取一次性连续的取完，血浆可以多保留些，血浆中也有部分PBMC。4 U1 _! X7 }9 r3 A: F0 l/ Z0 q
         五、因为不知道您具体要洗几次，所以建议可以适当增加合适的离心梯度。
         另外，目前有成品分离管，分离效果还不错，PBMC收集率挺高的，但是也要注意加血时要轻。希望能帮到您！

作者: xiepu1 时间: 2016-9-6 15:09

本帖最后由 xiepu1 于 2016-9-6 15:20 编辑 5 X$ w0 C8 |. j

首先血液质量要好，样品到后要立马开始处理，
其次血样尽量做到1:1稀释或大于，' h6 r: t4 w$ I ^/ J d
最后血样铺成要先慢后快，铺样过程要均匀

作者: 免疫与细胞 时间: 2016-9-7 10:27

不建议使用红细胞裂解液，加入步骤过多，此外红细胞裂解液还会影响PBMC。1：1添加ficoll离心，吸取时注意就好，这个需要练习。

作者: 修行 时间: 2016-9-8 11:40

假如只是这个血是这样的那可能就是血的问题，血象对分离有一定的影响，有些血会出现红细胞分开的情况。假如经常出现这样的情况，那就要考虑一下你们的方法问题，Ficoll离心要点就那些，多注意把控就行。自己多总结多分析会有好处的。

作者: 小沙弥敲木鱼 时间: 2016-9-11 18:45

最主要的是降速调到最低，效果会很好。

作者: sfnana 时间: 2016-9-12 13:14

不建议使用红细胞裂解液，对PBMC细胞也有损伤。使用品质较高的ficoll(GE的),控制好ficoll与血的比例（>=1:1），加血时一定要缓慢匀速加入。调好离心速率，根据实验室离心机的特点调节好升降速。离心分层后，小心吸取白膜层，原则宁可少吸一点，也不要吸到下层的红细胞层。

作者: biluolinyu 时间: 2016-9-20 14:16

回复伊诺强的帖子

请问FICOLL管使用前离心是为了使管壁上黏附FICOLL全部落回到管底部么？

作者: 伊诺强 时间: 2016-9-20 15:22

回复 biluolinyu 的帖子- \: O4 a9 Z! a) f

是的。新分装的ficoll或者之前已经分装离心过的ficoll管，时间长了会蒸发挂壁，影响分离效果。

作者: biluolinyu 时间: 2016-9-21 14:20

回复伊诺强的帖子0 s+ K! V6 {# b- r0 b

谢谢

作者: xiaodiao123 时间: 2016-9-27 09:53

我们平常提取也会有红细胞，当然肉眼可见。但其实并不影响后续培养，继续培养一段时间后，红细胞就会慢慢裂解了，基本到十天左右差不多，基本不影响后面的实验

作者: sky512829 时间: 2016-10-19 10:26

现在都有配套离心管加分离液后再加入外周血，分离后，细胞直接倒出来

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