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标题: 不同细胞接种浓度影响人脐带间充质干细胞生长及多向分化 [打印本页]

作者: abbyguang 时间: 2016-9-13 09:59 标题: 不同细胞接种浓度影响人脐带间充质干细胞生长及多向分化

不同细胞接种浓度影响人脐带间充质干细胞生长及多向分化
李  辛，刁  克，张凤香，孙大鹏 8 W4 e( K  M! }: B
, y0 N! J* I8 ^  ]/ I. w# Y! h, V
材料：脐带：足月剖宫产胎儿脐带由锦州凌河区妇幼保健院提供，脐带取自足月新生儿，均经父母授权同意。孕妇无传染性疾病，产妇及家属对脐带用于实验研究均知情同意。试剂和仪器：
方法：人脐带MSCs的原代培养：无菌条件下取脐带， D-Hank’s平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，并将其剪碎至1 mm× 1 mm×1 mm大小组织块。将组织块移至1 g/L的胶原酶Ⅱ 中，加入少许DMEM，在37 ℃恒温震荡仪内消化，直至 Wharton胶全部消化。将含细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的DMEM反复吹打稀释，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，用含体积分数15%胎牛血清的 DMEM/F12培养基清洗，使细胞悬液均匀分布，转移至普通培养瓶中，以5×104，1×105，5×105，1×106， 3×106/cm2的浓度接种，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。细胞贴壁后第3天首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每三四天换液1次。倒置相差显微镜下观察。细胞达80%融合后，2.5 g/L胰酶消化，按 1 2~1 3 ∶∶的比例传代，续扩增培养。于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。细胞表型测定：于24孔培养板内放置无菌盖玻片，取第2代细胞1 mL，按1×108 L-1接种。待细胞呈融合状态时，取出盖玻片，PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定 30 min，而后按试剂盒说明进行免疫细胞化学染色，一抗为抗CD166、CD44、血管性血友病因子抗体， 1∶100 稀释，湿盒内4 ℃过夜。隔天PBS冲洗3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗，1∶200稀释，37 ℃孵育2 h后， PBS洗涤3次，SABC显色试剂盒显色，显微镜下观察。诱导分化检测：成神经诱导：取第1代人脐带MSCs，以1×104/cm2 浓度接种于加入盖玻片的24孔培养板中，以含20 μg/L 碱性成纤维细胞因子、体积分数10%胎牛血清的 L-DMEM培养基培养，细胞进入对数生长期后将培养基更换为含有4 mol/L β-巯基乙醇的培养基中进行诱导培养，每隔1 h镜下观察细胞形态变化，诱导6 h。对照组加不含诱导剂的培养基。诱导6 h后取出细胞爬片，0.01 mol/L PBS洗3遍，每次5 min，以4 g/L多聚甲醛固定30 min，体积分数 3%H2O2与甲醇混合液室温下作用10 min后，体积分数 10%山羊血清封闭20 min，吸去多余的液体，分别行抗 Nestin、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。一抗分别为1∶200稀释的兔抗大鼠Nestin、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白抗体，4 ℃过夜。二抗为 1 400 ∶ 的生物素化羊抗兔IgG，37 ℃温育30 min，三抗 SABC 37 ℃温育30 min，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，封固。镜下观察并拍照。每种染色分别随机选取5张玻片，每张取5个不重复的视野计数神经元样阳性染色细胞，计算其占总细胞数的百分比，取平均值。成胰岛诱导：取第1代人脐带MSCs，经消化后以浓度 1×107 L-1接种于6孔板中，细胞达80%融合时更换诱导培养液，按诱导培养液成分不同分4组：NA组(含10 mmol/L尼克酰胺，10 μg/L活化素A)、NG组(含10 mmol/L尼克酰胺， 10 nmol/L胰高血糖素样肽1)、AG组(10 μg/L活化素A， 10 nmol/L胰高血糖素样肽1)；NAG(含10 mmol/L尼克酰胺，10 μg/L活化素A，10 nmol/L胰高血糖素样肽1)，在诱导第1~7天，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基，第8~21天，用含体积分数10%胎牛血清的 DMEM低糖培养基，37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度条件下培养，3 d换液1次。将诱导第21天的细胞行双硫腙染色，用100 mg/L的双硫腙溶液37 ℃孵育15 min，拍照。成脂诱导：取第1代人脐带MSCs，经消化后以1×  107 L-1接种于6孔板中，每孔中加入3 mL含有1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和100 μmol/L的吲哚镁辛的成脂诱导培养基，常规换液，3周后取出细胞爬片，PBS洗2次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，油红O染色15 min，体积分数60% 异丙醇分色至背景无色。主要观察指标：不同浓度接种细胞的原代培养及多向分化情况。统计学分析：所有数据均用x _ ±s表示，用SPSS 13.0 软件，采用单因素方差分析进行数据处理，P < 0.05为差异有显著性意义。 2  结果 6 z9 u" D' S) f$ t- b
2.1  不同浓度接种细胞的原代培养时间  原代培养结果显示，接种浓度为3×106/cm2组的原代培养时间为 (11.0±2.1) d，1×106/cm2组为(12.5±1.2) d，5×105/cm2 组为(13.4±3.5) d，1×105/cm2 组为(22.9±1.4) d， 5×104/cm2组仅有1瓶有细胞贴壁呈克隆样生长，但24 d 时仍不能传代，其余培养瓶无细胞生长。经统计学比较，前3组培养时间差异无显著性意义(P > 0.05)。说明以5×105~1×106/cm2细胞浓度接种的人脐带MSCs生长状态佳。 2.2  分离培养的细胞的形态及表型  显微镜下观察发现，接种的细胞6 h后开始贴壁，24 h后有部分细胞贴壁， 48 h后细胞完全贴壁生长，可见呈椭圆形、多角形的内皮细胞及梭形成纤维样细胞，有的形成漩涡状生长的集落。传代培养2 h细胞开始贴壁，24 h基本完成贴壁，传代七八天长满瓶底，见图1。
免疫细胞化学染色显示，细胞表面抗原CD44、 CD166阳性，而血管性血友病因子阴性。说明所得细胞具有MSCs的特点，见图2。                   2 E+ r0 R7 X& y/ q8 c
2.3  人脐带MSCs向成神经元样细胞的分化  倒置显微镜下观察，诱导3~6 h，人脐带MSCs形态变化明显，细胞向细胞核收缩，细胞变短，体积变小，部分细胞的细胞质收缩形成细胞突起。用生长因子维持诱导，细胞突起进一步延长和变细，折光性好，局部区域相邻细胞突起连成网状，部分细胞呈现典的神经元样细胞形态。也有少量细胞分化后体积较大、突起小而多、较少聚集，可能是胶质样细胞，还有少数细胞形态无变化，至正式诱导6 h，神经元样细胞明显增多。各细胞间紧密相连，形成网络样结构，见图3。) M" T! b/ I+ D/ M$ X& X
随着诱导时间的延长细胞死亡增多，超过24 h，细胞全部死亡，漂浮于培养液中。
免疫细胞染色鉴定结果显示，诱导6 h后的细胞中可见胞浆呈棕黄色的Nestin、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达，见图4。
2.4  人脐带MSCs向成胰岛样细胞的分化  诱导第7天，长梭形细胞突起变短，逐渐变为鹅卵石样，14 d时， AG、NAG组细胞近圆形，细胞折光性增强，有细胞团样结构出现，见图5a；21 d时，NAG组形成了明显的呈半悬浮状态的胰岛样细胞团，见图5b。NA、NG组细胞形态改变不明显。
双硫腙染色显示，21 d时，NAG组细胞形成了胰岛样细胞团，并且呈砖红色阳性表达，而NA、NG、AG 组没能形成明显的阳性细胞团，见图6。$ M% A8 d$ X( y; h8 F' C
2.5  人脐带MSCs向成脂肪样细胞的分化  人脐带 MSCs经成脂诱导培养基诱导后，可见少量细胞油红染色阳性，有明显脂滴出现，因此人脐带MSCs具有向脂肪细胞分化的潜能，见图7。$ s0 O3 L9 E, J0 W' W7 k
3  讨论
人脐带MSCs是一种从脐带Wharton's jelly中分离出的新型干细胞[7]，适合同种和异种移植，具有较强的自我复制能力和多向分化潜能，在体外能够被诱导分化为心肌样细胞及生殖细胞[8-9]。近年来，国内外学者对人脐带MSCs进行研究并取得了一定成果。有研究表明，脐带中富含干细胞，平均每厘米脐带组织中含有4×105 个，远远高于骨髓中的含量。脐带MSCs有望取代骨髓 MSCs成为组织工程中更为理想的种子细胞。实验结果表明，原代分离培养中，种植细胞浓度为5×105~ 1×106/cm2的方法较合理。可能是因为虽然用D-Hank’s 平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，但仍混有血细胞，当高浓度接种时浓度较大的红细胞先沉于瓶底，从而减少了MSCs的贴壁面积，同时细胞代谢废物和死细胞也明显增加，因此浓度大于 3×106/cm2并不能缩短MSCs培养时间；当接种浓度过低时，MSCs细胞贴壁明显减少，从而延长培养时间。因此，合理的接种浓度为获得生长性状稳定、增殖速度快、贴壁时间短、贴壁细胞成活率高的MSCs细胞起到了重要的作用。有研究表明MSCs具有向胰岛细胞分化的潜能[10]。实验成功将人脐带MSCs诱导分化为胰岛样细胞，并未使用可能会被细胞吸收而再分泌的胰岛素[11]，而应用尼克酰胺、活化素A和胰高血糖素样肽1形成的微环境。研究发现，尼克酰胺可以减轻胰岛素依赖性糖尿病患者的危险度[12]。尼克酰胺能促使体外培养的干细胞向胰岛细胞分化，增加胰岛细胞分化的数量，促进分化的细胞成熟，加快胰岛细胞团的形成，增强胰岛细胞团的功能[13]。但尼克酰胺诱导干细胞向胰岛β细胞分化的具体机制还不清楚，可能与其在诱导过程中可以保证细胞不至于凋亡或者向其他方向分化有关[14]。而活化素A和胰高血糖素样肽1 则有助于β细胞分化[15-16]。实验应用尼克酰胺、活化素A 和胰高血糖素样肽1几种生长因子形成的微环境。诱导第7 天，就可见长梭形细胞突起变短，逐渐变为鹅卵石样， 14 d时AG、NAG组细胞近圆形，折光性增强，21 d时， NAG组形成了明显的呈半悬浮状态的胰岛样细胞团，且双硫腙染色阳性，说明其胞浆富含锌离子，与β细胞相似。近年来，骨髓源和脐血源MSCs显示出良好的神经分化潜能[17-21]。关于脐带MSCs的研究并不多见，其分化潜能是否有别于骨髓MSCs和脐血MSCs，能否实现向神经细胞方向高效地诱导分化尚无肯定结论。Nestin为神经元及神经胶质共同的前体细胞专一性标记物，Jeong等[22] 研究表明脐带MSCs培养前后均能表达一些神经元标记物。实验结果显示，脐带MSCs经诱导后，细胞体积缩小，伸出突起，呈现出典型的神经元样细胞形态。免疫细胞化学染色显示细胞表达Nestin、神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白，因此脐带MSCs具有成神经分化能力。此外，实验还通过成脂诱导培养基诱导，油红O染色阳性，且可见有明显脂滴出现。说明人脐带MSCs在体外具有向脂肪细胞分化的潜能。总之，人脐带MSCs来源广泛、容易获取、免疫原性低、增殖分化能力强，恰当的人脐带MSCs培养方法，可以快速获得最大量的自体种子细胞，并可在一定的诱导条件下向神经元样、胰岛样、脂肪样细胞分化。因此，脐带MSCs可能是未来各系统疾病细胞治疗及基因治疗最具潜力的种子细胞[23-24]。

作者: 奇幻雪蓝 时间: 2016-9-13 14:54

图呢？图呢？:):):):):):)

作者: htc728 时间: 2016-9-22 09:36

不要等到人人都说你丑时才发现自己真的丑。

作者: 初夏洒脱 时间: 2016-9-26 09:18

顶的就是你

作者: biodj 时间: 2016-10-31 08:28

哈哈瞧你说的~~~

作者: highlight 时间: 2016-12-31 13:09

朕要休息了..............

作者: 桦子 时间: 2017-1-7 21:18

细胞治疗行业

作者: 若天涯 时间: 2017-1-11 21:06

好困啊

作者: ines 时间: 2017-2-7 07:44

呵呵大家好奇嘛来观看下~~~~

作者: 干细胞2014 时间: 2017-2-10 06:48

顶你一下.

作者: 小丑的哭泣 时间: 2017-2-22 15:35

做一个,做好了,请看

作者: 命运的宠儿 时间: 2017-2-25 04:36

来几句吧

作者: 小小C 时间: 2017-3-11 22:10

帮顶

作者: 甘泉 时间: 2017-3-23 01:09

围观来了哦

作者: tian2006 时间: 2017-4-6 00:10

先看看怎么样！

作者: wq90 时间: 2017-4-27 03:53

又看了一次

作者: dreamenjoyer 时间: 2017-4-27 22:10

世界上那些最容易的事情中，拖延时间最不费力。

作者: 安生 时间: 2017-4-29 01:01

看看..

作者: nauticus 时间: 2017-6-4 14:53

厉害！强~~~~没的说了！

作者: 考拉 时间: 2017-6-11 03:54

拿把椅子看表演

作者: htc728 时间: 2017-6-13 01:12

嘿嘿

作者: 我心飞翔 时间: 2017-7-8 11:43

谢谢楼主啊！

作者: apple0 时间: 2017-7-9 02:25

感觉好像在哪里看过了，汗~

作者: marysyq 时间: 2017-7-13 20:08

干细胞与动物克隆

作者: dd赤焰 时间: 2017-7-30 14:17

干细胞研究还要面向临床

作者: immail 时间: 2017-8-8 01:16

一个子没看懂

作者: ringsing 时间: 2017-8-20 05:17

好贴坏贴，一眼就看出去

作者: biobio 时间: 2017-9-30 10:10

帮你项项吧

作者: 三星 时间: 2017-10-17 02:40

朕要休息了..............

作者: 兔兔 时间: 2017-10-27 14:55

说的不错

作者: 修复者 时间: 2017-11-25 08:18

初来乍到，请多多关照。。。

作者: 追风 时间: 2017-12-14 13:01

顶你一下，好贴要顶！

作者: kaikai 时间: 2017-12-18 04:05

@,@..是什么意思呀？

作者: dongmei 时间: 2017-12-20 08:43

我来了~~~~~~~~~ 闪人~~~~~~~~~~~~~~~~

作者: 罗马星空 时间: 2018-1-25 08:54

我想要`~

作者: SCISCI 时间: 2018-2-2 02:01

这个贴不错！！！！！看了之后就要回复贴子，呵呵

作者: 一个平凡人 时间: 2018-2-14 17:27

昨天没来看了～～

作者: 风云动 时间: 2018-3-3 21:53

谢谢分享了!

作者: 刘先生 时间: 2018-3-20 15:35

楼主，支持！

作者: leeking 时间: 2018-3-28 23:25

真的有么

作者: 加菲猫 时间: 2018-4-9 22:39

希望可以用些时间了~````

作者: ikiss 时间: 2018-4-23 06:01

每天都会来干细胞之家看看

作者: 追风 时间: 2018-4-26 13:27

加油啊！！！！顶哦!!!!!

作者: SCISCI 时间: 2018-4-26 15:07

哈哈我支持你

作者: 黄山 时间: 2018-4-29 04:24

家财万贯还得回很多贴哦

作者: 小小C 时间: 2018-6-6 17:43

楼主good

作者: IPS干细胞 时间: 2018-6-7 09:10

琴棋书画不会，洗衣做饭嫌累。

作者: doors 时间: 2018-6-20 08:18

顶的就是你

作者: 三星 时间: 2018-6-23 09:54

有空一起交流一下

作者: 老农爱科学 时间: 2018-6-27 11:35

支持你加分

作者: 科研人 时间: 2018-7-26 00:47

不要等到人人都说你丑时才发现自己真的丑。

作者: 蝶澈 时间: 2018-7-31 14:35

干细胞抗衰老

作者: dongmei 时间: 2018-8-15 13:35

设置阅读啊

作者: 桦子 时间: 2018-8-18 23:13

佩服佩服啊.

作者: 咖啡功夫猫 时间: 2018-9-1 05:34

有才的不在少数啊

作者: renee 时间: 2018-9-10 19:09

观看中

作者: 求索迷茫 时间: 2018-9-14 23:41

呵呵都没人想我~~

作者: HongHong 时间: 2018-9-21 14:10

我卷了~~~~~~~

作者: 修复者 时间: 2018-9-23 06:53

勤奋真能造就财富吗？

作者: syt7000 时间: 2018-11-14 22:47

强人，佩服死了。呵呵，不错啊

作者: www1202000 时间: 2018-11-28 00:50

努力,努力,再努力!!!!!!!!!!!

作者: dataeook 时间: 2018-12-23 02:10

世界上那些最容易的事情中，拖延时间最不费力。

作者: cjms 时间: 2018-12-30 08:43

赚点分不容易啊

作者: 甘泉 时间: 2019-1-18 18:32

谢谢分享了!

作者: 苹果天堂 时间: 2019-4-4 15:42

我顶啊。接着顶

作者: abc987 时间: 2019-5-12 09:01

我喜欢这个贴子

作者: 老农爱科学 时间: 2019-5-30 03:08

这贴子你会收藏吗

作者: dglove 时间: 2019-6-7 05:29

顶顶更健康，越顶吃的越香。

作者: lab2010 时间: 2019-6-18 16:16

发贴看看自己积分

作者: 咖啡功夫猫 时间: 2019-6-24 02:16

家财万贯还得回很多贴哦

作者: yunshu 时间: 2019-8-6 12:18

胚胎干细胞

作者: youngcell 时间: 2019-8-19 00:54

都是那么过来的

作者: 一个平凡人 时间: 2019-9-14 15:39

这个贴不错！！！！！看了之后就要回复贴子，呵呵

作者: 橙味绿茶 时间: 2019-9-25 10:11

我仅代表干细胞之家论坛前来支持，感谢楼主！

作者: 20130827 时间: 2019-10-18 01:55

呵呵，等着就等着....

作者: Diary 时间: 2019-10-22 23:54

文笔流畅，修辞得体，深得魏晋诸朝遗风，更将唐风宋骨发扬得入木三分，能在有生之年看见楼主的这个帖子。实在是我三生之幸啊。

作者: popobird 时间: 2019-10-30 08:18

原来是这样

作者: hmhy 时间: 2019-10-30 23:48

加油啊！偶一定会追随你左右，偶坚定此贴必然会起到抛砖引玉的作用~

作者: 小倔驴 时间: 2019-11-9 04:34

我回不回呢考虑再三还是不回了吧 ^_^

作者: youngcell 时间: 2019-11-12 14:59

一楼的位置好啊..

作者: youngcell 时间: 2019-11-25 05:53

干细胞治疗

作者: xiaomage 时间: 2019-12-18 18:41

风物长宜放眼量

作者: s06806 时间: 2019-12-22 23:35

我喜欢这个贴子

作者: 化药所 时间: 2019-12-23 18:28

昨天没来看了～～

作者: Greatjob 时间: 2020-1-11 07:09

原来是这样

作者: tian2006 时间: 2020-2-10 16:41

来几句吧

作者: youngcell 时间: 2020-2-19 16:43

呵呵那就好好玩吧~~~~

作者: keanuc 时间: 2020-3-16 09:18

不错的东西持续关注

作者: 三好学生 时间: 2020-3-21 19:24

感谢党和人民的关爱~~~

作者: tian2006 时间: 2020-3-28 06:46

干细胞行业

作者: 三好学生 时间: 2020-4-7 20:57

好困啊

作者: 杏花 时间: 2020-4-9 18:55

几头雾水…

作者: 咖啡功夫猫 时间: 2020-5-8 11:17

谢谢哦

作者: 983abc 时间: 2020-5-9 23:12

真是天底下好事多多

作者: 与你同行 时间: 2020-5-11 02:39

一楼的位置好啊..

作者: dypnr 时间: 2020-5-15 13:19

今天临床的资料更新很多呀

作者: dypnr 时间: 2020-5-19 04:10

一个子没看懂

作者: 某某人 时间: 2020-6-29 06:04

几头雾水…

作者: 锦锦乐道 时间: 2020-7-5 06:24

表观遗传学

作者: lab2010 时间: 2020-7-12 17:39

支持一下

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