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标题: 初来乍到，这里想求助一点关于流式前期标记时的准备工作 [打印本页]

作者: lhsll0728 时间: 2016-9-18 16:23 标题: 初来乍到，这里想求助一点关于流式前期标记时的准备工作

1．       细胞经胰酶消化，1000rpm 10min,PBS洗2遍。) j6 o: W/ h" z0 V
2．       PBS重悬细胞，分装至EP(1ul/管)，2000转 6min 离心，弃上清，拍散细胞，加1ul抗体/管(塑料小瓶包装)，10ul抗体/管（大玻璃瓶包装）。注意：加完抗体的管子要马上盖盖，避免混淆。4 ]' o$ x  |. [& w
3．       4℃避光孵育30min,各管加1mlPBS, 2000转 6min 离心，重复2遍。
4．       最后加0.5mlPBS重悬，再用滤膜过滤除去细胞团以避免堵塞流式仪。

这是之前在版里找到的步骤，不过有一些地方不太明白，比如同型对照的准备，请问有没有稍微详细些的步骤作为参考？

作者: yingfeixiang 时间: 2016-9-18 16:44

看你要检测什么了，都是对照管，这个是调节电压的，之后是补偿管，调节荧光补偿的，之后就是正式样本检测了，不管是几色的基本都是这样

作者: lhsll0728 时间: 2016-9-18 16:55

回复 yingfeixiang 的帖子6 Z0 R7 E% N+ U9 Z h
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检测CD73-APC，CD90-FITC，CD105-PE，CD45-percp，CD34，CD14，CD79a，HLA-DR ，然后我找到的这个操作好简略，不清楚有没有稍微明确点的。。。。

作者: yingfeixiang 时间: 2016-9-19 10:21

测的什么细胞，间充质吗

作者: 天龙八部 时间: 2016-9-27 17:12

细胞重悬和染色的时候用FACS buffer比单纯的PBS好。

作者: chuanchuan 时间: 2016-10-17 18:02

1、空白对照是细胞物理参数的一个阴性对照，看的是不加标记的细胞物理参数和荧光参数的本底水平，是调节机器电压参数的依据；
2、同型对照是细胞用同样荧光染料标记的同型非特异性抗体标记后的阴性对照，是用来排除抗体本身造成非特异性染色的对照，二者不可相互替代；同型一般和空白对照组的荧光水平是差不多的，但是如果你是用的抗体在你所标记的细胞上有较高的非特异性结合的话，那么就会出现这种荧光水平较高的现象，你在进行流式分析的时候以同型对照作为划分阳性水平的标准即可。如果本地过高则意味着这种抗体不适于的你实验，需要更换抗体克隆；7 q7 t" `* A) O2 R g0 Q
3、另外还必须设置各种单色染料的单色标记对照，用于调节机器的补偿值，减少不同通道间的干扰。

作者: 免疫与细胞 时间: 2016-10-19 10:34

给你的流式细胞仪所在厂家工程师打电话，他们有义务帮你做一套流程。

作者: lchanlon 时间: 2016-10-20 04:10

There are a tons of protocols on website of companies that have business of antibody like Abcam, Stemgent. These protocol are very detailed. Just follow their protocols. I used some of them. They are great. " t/ _0 q- B8 U2 p' K% t: J# N& j
http://www.abcam.com/protocols/r ... -for-flow-cytometry
https://www.stemgent.com/support/protocols. m+ S$ L* ]4 N) K/ V! p# b

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