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标题: 实验室常用的细胞冻存和复苏方法 [打印本页]

作者: sea663 时间: 2009-6-8 14:51 标题: 实验室常用的细胞冻存和复苏方法

冻存方法

1．细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。
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2．计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数，令细胞密度达5×106/ml，离心去上清，吸入离心管中。
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3．冻存液：先用培养液9分＋DMSO 1分（或甘油）配成10％的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。* F4 Q# z/ Z6 H) X$ z" Q. i/ t

4．分装：分装入无菌安剖中，每安剖加1.5毫升细胞悬液。

5．封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安剖口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安剖缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找。
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复苏方法: ]! S$ U7 J! C3 k. d, s5 F
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1．从液氮罐中取出安剖；有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。

2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。; J: u$ S/ X$ r
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3．剪开纱布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮。
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4．低速离心（500～1000转/分）5分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心。0 C3 |& H9 L5 ^
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5．加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。

作者: sajia 时间: 2009-8-27 17:23

顶一下

作者: mmssyyee 时间: 2009-9-12 00:00

每安剖加1.5毫升细胞悬液,再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮.
请问需要加这么多的培养液离心吗？) V9 X, I( _2 W

谢谢

作者: zpzp0312 时间: 2009-9-12 14:38

3# mmssyyee

帖子中的方法针对大批量细胞冻存
如果是小批量的，完全可以在冻存管中操作5 h7 a- |1 Z7 O& w! V
另外冻存密度还可以适当降低，当然也要考虑到细胞种类。

作者: mmssyyee 时间: 2009-9-13 21:42

4# zpzp0312 [谢谢您的解答。
作者: askage 时间: 2010-2-11 15:47

感谢楼主分享
作者: duoduo777001 时间: 2010-3-17 08:35

顶顶
作者: rocfield 时间: 2013-11-18 13:15

回复 mmssyyee 的帖子
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加10ml培养液是为了稀释DMSO,降低DMSO浓度避免高浓度DMSO存在对细胞膜的损伤使离心时细胞膜破裂。
作者: gondobar 时间: 2013-11-20 16:10

小批量的采用冻存管先-80℃ 然后液氮
作者: 穿裙子的猫 时间: 2013-12-21 10:04

补充一下哈，冻存的时候，我们使用两种冻存方式，; M0 ^3 D) |& Z& a5 f
一种是直接使用程序冻存盘，就是把冻存的细胞直接放入冻存盘，放入-80°C，过夜之后就可以放入液氮了，
A, r- L! [) y另外一种是没有程序冻存盘，4°C冰箱半小时，-20°C冰箱2小时，然后放入-80°C过夜后放入液氮保存。
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作者: lazhla 时间: 2014-1-9 14:58

复苏，先用4°C预冷的生理盐水洗涤，离心，弃上清。加培养基重悬，取少许悬液计数，离心，弃上清。这两步主要是为了把培养基中的DMSO去除，然后根据需要重悬细胞。

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