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标题: iPSC的一个基本问题？求解答！ [打印本页]

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-7 09:40 标题: iPSC的一个基本问题？求解答！

最近在做成纤维细胞向干细胞的诱导重编程！诱导一定天数形成形态很像ES细胞的克隆，连续传代以后能继续稳定形成克隆（更多），但免疫染色结果只能染出Sox9，却染不出Sox2、Oct4、Sox17以及Foxa2,那么请问一下，我这个细胞目前处于一种什么样的状态？具有部分干性？要想得到真正的干细胞，接下来我该往哪个方向努力？求各位大神、前辈、同行指导！

作者: yeshch 时间: 2016-12-7 10:24

我自己也没有重编程过，只是看过实验室其他人做，最好上图片，表明是哪一代，那一天，什么细胞。人的和鼠的差别挺大的。至少OCT4，NANOG应该有的

作者: genedu 时间: 2016-12-7 10:46

首先检验一下抗体是否好用或者失效。其次建议诱导iPSC的时候用OG或者NG的成纤维细胞系，这样一开始就能挑取质量好的单克隆。另外，多挑取几个单克隆系，有的细胞系就是不好，别较真儿

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-7 10:51

回复 yeshch 的帖子( X0 w% u" x1 l) S: ]2 B" H
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这个真的不太方便放上来谢谢理解

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-7 10:51

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谢谢你的建议

作者: sunsong7 时间: 2016-12-7 15:14

iXEN（胚外内胚层）

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-7 23:03

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求进一步解释！谢谢！

作者: sunsong7 时间: 2016-12-8 09:30

extraembryonic endoderm cells （XEN）是细胞重编程过程必经的桥梁
Zhao, Yang, Zhao, et al. A XEN-like State Bridges Somatic Cells to Pluripotency during Chemical Reprogramming[J]. Cell, 2015, 163(7):1678–1691.
Beyret E, Belmonte J C. The XEN of reprogramming.[J]. Cell Research, 2016.0 k' ?+ K6 Q1 V* P+ q% L

作者: sunsong7 时间: 2016-12-8 09:37

Séguin C A, Draper J S, Nagy A, et al. Establishment of Endoderm Progenitors by SOX Transcription Factor Expression in Human Embryonic Stem Cells[J]. Cell Stem Cell, 2008, 3(2):182-95.

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-8 09:52

回复 sunsong7 的帖子 f, W! M4 K! C6 A/ `- j

里面却有明确说明这个过程必须经历Sox9 positive and Sox2 、Oct4、Sox17、Foxa2 negative 过程吗？谢谢

作者: sunsong7 时间: 2016-12-8 10:05

2013年，邓宏魁研究组曾使用以四个小分子为主的小分子化合物组合对体细胞进行处理，成功逆转体细胞“发育时钟”，实现了体细胞的重编程，将已经特化的小鼠体细胞诱导成为可以重新分化发育为各种组织器官类型的多潜能性细胞，并将其命名为CiPS细胞。使用化学方法诱导体细胞重编程，摆脱了以往的重编程方法对遗传操纵的依赖，为再生医学开辟了一条新途径。最新研究成果中，邓宏魁研究组发现了在化学重编程早期产生的一个上皮样细胞的中间状态，这一中间状态的细胞共表达Sall4, Gata4, Gata6和Sox17等转录因子，在细胞的基因表达谱和体内发育能力上类似于胚外内胚层(XEN)细胞。$ l8 o/ C& w9 w' N* l* ^
http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S009286741501497X

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-8 10:57

回复 sunsong7 的帖子* i, G! w' F8 J" `& V' [4 d8 u- I

请问是哪四个主要小分子？

作者: sunsong7 时间: 2016-12-8 11:14

Pingping Hou, Yanqin Li, Xu Zhang, Chun Liu, Jingyang Guan, Honggang Li, Ting Zhao, Junqing Ye, Weifeng Yang, Kang Liu, Jian Ge, Jun Xu, Qiang Zhang, Yang Zhao, Hongkui Deng. Pluripotent Stem Cells Induced from Mouse Somatic Cells by Small-Molecule Compounds. Science, July 18 2013; DOI: 10.1126/science.1239278

作者: sunsong7 时间: 2016-12-8 11:18

[attach]82270[/attach]Li X, Zuo X, Jing J, et al. Small-Molecule-Driven Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Functional Neurons.[J]. Cell Stem Cell, 2015, 17(2):195-203.

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-8 12:07

回复 sunsong7 的帖子
" F1 W: F$ k6 `' i% }9 P! Y/ y! C$ o
对可是在某些细胞上面，这些小分子并不太好用。需要进一步摸索条件吧！

作者: gscao 时间: 2016-12-12 18:15

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这也是我非常关心的问题。在诱导iPSCs过程中，按诱导时间，哪些基因有规律的先表达，哪些基因后表达，最后表达Oct4和Nanog基因后，基本说明诱导细胞处于iPSCs阶段。例如：AP+ 到SSEA-1+到Oct4+到Nanog+，按时间顺序还有更好的标记基因吗？

作者: 基因疗法 时间: 2016-12-13 06:55

为什么不试试罗式的iPS鉴定试剂盒，里面有Sox2, OCt4, Nanog，还有Tra-60,80，以及AP staining，这个可以了就打个裸鼠看看畸胎瘤，有公司可以做

作者: 张月儿 时间: 2016-12-15 09:08

我们实验室主要以Oct4和NANOG为marker，如果这两个都没有，估计你这次就失败了。还是从头来比较保险。

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-15 09:17

回复张月儿的帖子$ C5 L4 \2 {* u5 g
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未必吧毕竟重编程是一个漫长的过程可能是大致的方向对了但停滞在某一个Stage 所以需要进一步摸索条件如果只是没染出来Oct4 和Nanog 就判定实验失败？未免太仓促了我想你们用的细胞一定是之前别人做出来过的吧？

作者: 张月儿 时间: 2016-12-15 09:33

回复 gxbzjznn 的帖子% Z7 X! h" T! V% h8 Z
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不是的，我们是自己诱导的，但是一般正常的话，诱导效率还蛮高，所以，如果出现您那种类似情况时，一般会选择放弃，因为不定因素太多了，对后续实验结果也可能产生影响。

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-15 09:35

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方便问一下你们做的是什么物种的细胞吗？转了TF了吗？还是纯化学方法？

作者: 张月儿 时间: 2016-12-15 09:50

用的慢病毒法转TF，C57小鼠的MEF细胞诱导而成

作者: gxbzjznn 时间: 2016-12-15 10:16

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对啊所以我们做的不一样当然没有可比性你们这个细胞以及方法都是很成熟的了吧

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