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标题: 大鼠BMSC，这个原代的形态如何？ [打印本页]

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作者: whyme705    时间: 2017-1-3 19:34     标题: 大鼠BMSC，这个原代的形态如何？

新手想请教各位大神们，这样的BMSC形态如何？断断续续养了好几次原代了，感觉每次不是P0就是P1就会老化，心塞
8 _. G( ]* ?% D% A7 \
3 \7 |; H: Z9 X: L3 {这次的BMSC取自150g左右大鼠，全骨髓贴壁法，24h首次全量换液。培养体系为αMEM+10%FBS+双抗+谷氨酰胺。
* t& s* x2 ?4 ~+ \  H. @以下均为原代第4天的图。  f' b0 W  E4 b2 L; C  Y
感觉很多细胞呈多角形啊
" B& y0 C5 T' Z; h
- z; X' s/ x3 W# k6 P8 i; w! H[attach]83083[/attach]  x" f9 ]. Z- r3 E- G: D: H
[attach]83082[/attach]
7 |( h# e! \0 X7 |7 m[attach]83081[/attach]2 F4 o2 c, ~# i" R  Y+ s  {; r
[attach]83080[/attach]
% Q, P) x  g; t8 e* I# p[attach]83079[/attach]
  E8 O. R( B- |! F) H% d0 ~[attach]83078[/attach]+ r3 ?' C% {# E5 d. S+ w+ l& W

' g, I, @, z9 J% Z4 ]: v
  }" ]$ W6 N: w另外，有时候感觉原代长得还行，一传代就立马成扁平状了……0.25%胰酶含EDTA，消化控制在2Min左右，还是不行。有没有哪位大神可以不吝赐教？( j5 k1 t# [) }0 F( n0 Q* Z

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作者: zhongjianzhj    时间: 2017-1-4 06:38

the cell morphology looks great, Maybe you should add some growth cytokine to maintain the stemness. Usually for mouse BMSC we add some cytokines combination and it can maintain fibroblast morphology to passage 6~8.

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作者: fm001982    时间: 2017-1-4 09:07

原代细胞感觉还行。! K% {# u' R. T# ?" E$ F: v
消化有问题。一般用0.125%胰酶消化一分钟左右就行了，边观察边消化，时间并不是固定的，要自己把握。用0.25%胰酶不好掌握时间，不推荐使用。2 Q& J% \3 k0 j# q8 [' c' ?! Q
你的原代细胞本来数量有限，还用0.25%胰酶消化2分钟，酶浓度高，时间长，应该就是消化出的问题。

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作者: whyme705    时间: 2017-1-4 09:19

回复 zhongjianzhj 的帖子2 Y* _2 Z+ G, q- y
) A$ p" w6 G! w! D& ^; j
谢谢！ 生长因子指的是bFGF吗？

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作者: whyme705    时间: 2017-1-4 09:28

回复 fm001982 的帖子
# U% c7 m. z% O: ?9 f3 y  Y! u6 Q! _, J/ K1 g5 X
谢谢！ 可是有时候感觉消化了两分钟有的细胞还没有回缩，看很多帖子对于消化难易程度的说法也是各持己见。是不是这部分难以消化的细胞就不是MSC了？

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作者: fm001982    时间: 2017-1-4 11:07

回复 whyme705 的帖子
, o4 n* J6 i9 k: B' ^
: V% o9 Q3 G6 O" ^5 h5 y, @好吧，我给你细说。
# U! P! _8 E& X0 @消化时首先让酶液均匀分布，适当晃动，消化30S后，用力拍打培养瓶，显微镜下观察，大部分细胞飘起来了，即可终止消化。
8 i& j' s5 P" S- W, h) w4 n我一般在37度下放置30S，室温下，一般是25度，边观察边消化，一般1分钟内完成原代细胞的消化。1 I7 L# D0 @) r
9 k# @" b+ N# b( J; i
间充质干细胞有条件就加bFGF，5-10ng/mL。
7 B3 t, v8 @+ y  @+ I, B$ q
3 I; W% x# o% J; ~# M做实验要多问有经验的人，最好能看着人家做一次。

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作者: whyme705    时间: 2017-1-4 13:51

回复 fm001982 的帖子
0 {, |! r4 C" b8 d3 c% V$ p
9 a+ t! d4 n1 S0 f( K- b" F/ N5 }非常感谢你的回答。就是因为周围都没有在养这个细胞的人，所以只能上来发帖问问了。
8 D0 L/ s5 a7 h
2 a/ B; r+ [7 I! {5 F昨晚给原代传代了，还是用的0.25%的胰酶，观察到大部分细胞消化好后即终止，整个消化过程也就1min左右，最后一些吹打不下来的细胞就放弃了。但今早来一看，形态又变大了。
, v0 v  C, u/ i. O4 W7 Y: e4 r1 @如果是胰酶浓度的问题的话，我下次稀释一下试试

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作者: whyme705    时间: 2017-1-4 13:56

这是传代后的图。。) g( B6 |; Z+ q# T: W5 O2 @" \7 @8 g

' v4 o" c  {% ~' L* Y0 ~7 a
/ c3 |( s$ V' D, y

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作者: fm001982    时间: 2017-1-4 14:11

你这两张图，细胞有损伤，接种密度也可能有问题。

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作者: lgfffancy    时间: 2017-1-4 16:11

细胞形态 还行，可以勤换液，等融合度达到90%再传代。+ f& @# h: T4 o7 v: h* u% x: h
经验之谈。

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作者: whyme705    时间: 2017-1-4 16:30

回复 fm001982 的帖子  H4 U  J7 Q1 C" u% D0 o

" ?- Y. U7 B5 X$ F' X* F8 V* {密度的话 我没有计数 就图里看来 这个密度算稀吗？

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作者: whyme705    时间: 2017-1-4 16:44

回复 lgfffancy 的帖子' I' h" O7 r- O; s8 Z( z" O. W8 L

* R0 B7 [0 J4 J6 L啊，我还看到好多人说80%就该传了……
* h: c6 U& n) Z可能我养BMSC还不是很熟，我感觉原代的细胞分布均匀程度不好控制，而且有时候密集处长到80-90%的时候有的细胞就有老化的迹象了，稀的还是很稀，再传代也救不回来了啊。
3 N6 r7 E' _2 I勤换液的话，能够防止老化的发生吗？

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作者: fm001982    时间: 2017-1-5 09:27

回复 whyme705 的帖子: Z( \0 i  H- ~8 c
, J$ E, Y! G9 i6 `5 x# q& L* z
你是在校学生？有时间多看书，感觉你很多细胞培养的基础知识比较匮乏。( [/ u& l. I. h2 S3 \

5 ~3 t9 d4 g! ~* W0 E一般细胞长满一块培养瓶，可以按1:3的比例传到另一个瓶，如T25传T75。0 Z( J  m, L$ Z7 a0 C! k' N' Z2 Q2 l
你的细胞状态不好，更要计数，按8000-10000每平方厘米传。
: d. u! P; d: U  i
$ ^% N1 e$ f& R& G还有就是，细胞密度低了更容易老化，而且老化的细胞注定老化终生了。

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作者: lgfffancy    时间: 2017-1-5 09:54

回复 whyme705 的帖子
. ]5 G3 @- N6 I1 J; s- v& ?8 }( Y3 N
这个 很简单，传代的时候，吹成单细胞 悬液
6 Y1 v* P$ {9 _7 T然后小心平放于培养箱中就行了。
' n6 M& E/ y2 j1 }' ]经验之谈。

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作者: xulu921    时间: 2017-1-6 08:25

回复 fm001982 的帖子
3 p- X# I! ]) }. ^" M# n; y( T; I* d# ]4 x: H+ u% P( v
你好，我也是MSC培养的新手，我想知道你是怎么判断细胞老化的呢？每次师姐说我的细胞老化了不能用了，我都不知道她是怎么判断的，望大神指教

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作者: fm001982    时间: 2017-1-6 13:23

回复 xulu921 的帖子
! z' V2 C+ }& H
, w3 J; G' k( a1 E2 w- T4 A: `3 k; W  i你可以问下你的师姐，她的判定标准是什么，大家也好共同交流学习。0 y4 c& J4 l" A' y. W
! J9 d, y$ v$ X1 |' c' F5 M
MSC是呈漩涡状生长的，老化细胞可能漩涡状不明显；
3 @9 u/ g" P2 S4 G9 d( @老化细胞折光度下降，也就是立体感逐渐消失；6 H2 ~; k- I8 l! [3 Q
MSC正常形态是呈梭状的，边缘比较光滑，老化细胞形态不统一，有的开始肥大，有的出现空泡，细胞边缘突出部分明显增多，甚至呈锯齿状。: l, p* g% `' E$ U4 @% p
老化细胞可能增殖能力下降，不过我的老化细胞增值能力还行。2 g% m. u6 y4 F+ S- Z9 O( S
据说老化细胞的CD分子标志物正常，不过我还没做过流式。
: O! s7 F- }1 o) x) r$ x" [8 m最后，细胞观察的结果应该是大部分的细胞状况，少数细胞出现异常并不能代表什么。
5 O' V2 }6 L# o7 `1 V+ k, v; c这是我个人的经验，仅供参考。$ b! r) Q# g; p% I

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作者: 蚂蚁上树    时间: 2017-1-6 13:31

应该是接种密度太低了，细胞生长需要一定的细胞分泌的一些因子成分，密度太低的话，那些因子含量太少，不利于生长。

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作者: xulu921    时间: 2017-1-6 14:41

回复 fm001982 的帖子
# g7 V4 ]( C2 ?, d& h' S
0 Y4 V; M( A4 [! C% v+ Z非常感谢你分享的经验，回头问问师姐她是怎么判断的再来分享给大家

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作者: 蓝林冰泽whac    时间: 2017-1-9 19:09

我前段时间也养了和你同样的细胞，看你原代细胞的形态挺好的啊，传代应该是没有问题的哇，我传代是用的GIBCO的胰酶替代物，消化2分钟的样子，具体要看细胞有没有边缘，回缩，还有最重要的是传代时接种密度应该要高一点，特别是前面几代，我看你传代后细胞密度太少，这样细胞也不容易长，并且特别容易老化

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作者: 一僧化画    时间: 2017-4-20 11:23

$ M/ U- l: g! A8 o! [' B( c* q
原代细胞感觉还行。1 C+ ^# w4 Y7 O6 q) d: h
* _2 w+ {' W  L9 ~8 T) Z! T: r# c消化有问题。一般用0.125%胰酶消化一分钟左右就行了，边观察边消化，时间并不是固定的，要自己把握。用0.25%胰酶不好掌握时间，不推荐使用。: [: ]9 w& b( o1 G0 X6 d! u, t! Z! ?: q/ a
你的原代细胞本来数量有限，还用0.25%胰酶消化2分钟，酶浓度高，时间长，应该就是消化出的问题

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作者: whyme705    时间: 2017-4-22 15:42

回复 一僧化画 的帖子
6 `+ K+ c6 T+ j; I2 V7 b% Z8 B1 ^( D" e- F! ?2 Q
感谢回答。后来我也用过0.125%的胰酶消化过，但感觉还是不能解决后来老化的问题。
: L+ P4 P# v: _! Q' m. D再后来我换了个专用的BMSC培养基，做过二者的对照，手法跟原来一样，但后来细胞就能长得很好。! R* I5 t. ~5 T* \$ }3 J
所以我想，是不是我的培养基或者血清的问题，或者可以加点生长因子试试

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作者: zhouyonhzhan    时间: 2017-4-23 16:10

传代后细胞有问题7 Z% f" ]8 f. j; ]- `% D3 k# `0 P% l# }
& {  Z+ y9 k7 Q- Q: v

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