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标题: MEF复苏后不贴壁的原因？ [打印本页]
作者: nmnannan    时间: 2009-6-18 14:03     标题: MEF复苏后不贴壁的原因？

第一天 复苏CF-1 MEF 原代 （09.3.19）8 r; ~, m& Z3 W6 h5 o
   完全培养液MEM（含双抗，L-GLutamine,） 百分之十血清 ,百分之一的NEAA
$ |/ b8 {" Q6 W   液氮中取出后，37度摇晃约1分钟，移至含有5ml完全培养液的瓶中（带透气膜），37度，百分之五的CO2培养箱中。
; o! U$ w3 `9 J! Y, z   第二天  24小时后几乎没有贴壁细胞。离心后重新培养
7 _+ Y' X8 k; j( O9 g; A; {  第三天 仍未见贴壁细胞
0 g6 ?4 Y# T$ O1 E$ k9 l+ f   您能帮我找出一些原因吗？希望您能在百忙之中帮助我！谢谢！
作者: nmnannan    时间: 2009-6-18 14:05

第二次复苏经历：2 O0 V3 ?: `: r9 ]

" U1 F( }; x& U* v离心后培养，转天还是不贴壁。。。
2 ~. a! O$ u2 c! a什么原因呢
作者: hualin840518    时间: 2009-6-18 14:16

作者: 泡沫清风    时间: 2009-6-18 14:17

用的是新T25瓶子吗？
作者: 饶冠华    时间: 2009-6-18 14:21

建议你复苏的时候用台盼蓝染色 看看活细胞的比例  我觉得有可能是你冻存的时候出了问题   如果确认了复苏之后活细胞比例很大的话  建议把复苏时血清浓度增加到15%~20%
作者: telomerase    时间: 2009-6-18 14:23

虽然没亲手养过但见过
  G6 j& \7 m. x) ?5 P0 H$ NMEF  铺之前，板子要用Galtin （评的？）包被的
作者: 饶冠华    时间: 2009-6-18 14:24

另外，原代细胞就是冻存后存活率相对低，所以冻存的时候细胞密度一定要大  至少10^6/ml冻存密度
作者: 泡沫清风    时间: 2009-6-18 14:25

虽然没亲手养过但见过& \2 S  j" s; m' K' c
MEF  铺之前，板子要用Galtin （评的？）包被的
8 x* I* r! _/ ytelomerase 发表于 2009-6-18 14:23
0 A' ^5 A: ~3 w+ F
老陈在养的时候瓶子里没有加Gelatin
作者: have-a-rest    时间: 2009-6-18 14:26

首先准备培养皿/瓶，铺上0.1%的明胶30min以上；" |. N# D2 x' H" k% }
解冻后用5-10ml培养基重悬，离心1000rpmx5min；
, o& I+ A  q) x  q' p- z: X8 c铺板。
& L6 d) ~: F7 Z; N' N培养基：DMEM（Gibico高糖）+10%NCS（小牛血清，Hyclone），双抗。
2 M( q+ m2 b+ _. U7 I如果是ATCC购买的，严格按照说明书操作。
. `2 H: x( N0 c祝顺利！
作者: telomerase    时间: 2009-6-18 14:27

要是冻的问题，那就没办法了
作者: 泡沫清风    时间: 2009-6-18 14:41

本帖最后由 泡沫清风 于 2009-6-18 14:44 编辑 5 G" K! ]" V5 B& D" k$ _
; r# a; f8 t% x5 @" G
我总结下上面的啊：2 S3 O( n& D% U+ F/ a
一：查一下是不是冻的问题或者复苏的问题：用苔盼蓝计数，看看活细胞的比例" ^7 c! w/ M( e, l
二：你的瓶子是不是新的，是玻璃的还是塑料的（新的和旧的，玻璃的和塑料的相差很大的哦！）。3 ^. ]2 C+ ]5 K
三：预铺一下Gelatin试试看（但是我觉得Gelatin都是要把Es往mef上铺的时候才处理的）
作者: 痞子的烟头    时间: 2009-6-18 14:53

建议你用42度复苏，还有养MEF最好用20%血清，不用加NEAA！6 O# q% g$ U& R* i) S
我想你细胞可能的原因，一是你冻存时有可能存在问题，DMSO等对细胞损伤厉害
% p. F! h1 F! a4 w如果情况还是这样，你可以试着加0.01%ploy(LYS) 检测下是不是细胞的问题？
作者: zpzp0312    时间: 2009-6-18 16:36

要是冻的问题，那就没办法了
1 x5 A+ m- ?1 W9 s& \4 d. Ttelomerase 发表于 2009-6-18 14:27

! }) u: ~# A, l5 T嗯
$ l0 Y) S$ O7 e4 a5 }: L; [如果是由于冷冻造成的细胞死亡。
0 K& |# t) b3 i3 O建议将冷冻方法优化一下！
作者: nmnannan    时间: 2009-6-18 20:45

谷氨酰胺要2周加一次吗？养MEF时候。
作者: nmnannan    时间: 2009-6-19 13:00

谢谢大家
作者: cortex    时间: 2009-6-19 14:23

应该铺上明胶，0.1％到0.5％都行。
  W. a% G/ m7 s' h0 b我买过，从atcc公司的，按说明书培养，应该没什么问题的。9 w) n8 Q' E; w/ v
说明书饲养配方是：培养基：DMEM（Gibico高糖）+15%FBS（Hyclone）＋L-glutamine－NEAA＋双抗  |. x) k- g6 |1 |0 F
祝好运！
作者: cortex    时间: 2009-6-19 14:25

而你的细胞不贴壁，看来问题可能主要还是在细胞上。你可以看看你的悬浮的细胞发不发亮，如果不发亮的话，估计是你冻存的问题了。
作者: have-a-rest    时间: 2009-6-19 16:02

CF1原代，09.3.19。显然是买回来的，国内就没有这种老鼠。
" m& |7 G, t( v, P如果你是严格按照说明书操作的，那也许就是运输过程出了问题，或者拿回来后没有保存好。即使不铺明胶，即使培养基不太合适，这种细胞也不可能一点也不贴壁。所以，我觉得细胞在铺到瓶子里之前，已经基本全部死掉了，阿门。索赔吧！如果还有没解冻的，可以叫代理商技术员前来鉴定。这种细胞还是有点贵的，500-2000元/支。
作者: nmnannan    时间: 2009-7-12 15:41

最后还是没有找出原因，卖方已经同意赠送等量细胞了，再试试看。感谢大家！欢迎大家继续交流！
作者: yaner    时间: 2009-7-16 14:00

这个培养基不用加NEAA，铺板前不用GELATIN，但是原冻存液中的DMSO一定要除去，否则会影响细胞存活，
作者: yaner    时间: 2009-7-16 14:01

在室温状态下，细胞在ＤＭＳＯ中越久，死亡率越高
作者: xionghao508    时间: 2009-9-5 15:38

原因应该在三方面：第一，冷冻前你有没有检查细胞的活力；第二，复苏后的培养基条件（包括血清）是否与冷冻前一致；第三，复苏后的密度是否大，至少不能低于5*10^6。. ^) C1 Q- v( ~6 L: y: f* _" }
我们实验室的冻存MEF一般复苏都很好，其它的没有什么技巧性，关键是我们复苏的密度很大，我基本是10^7—10^8个/ml，所以即使死的细胞多，复苏率低得很，但是我的复苏密度高，最终总能长起来，这是我的一点经验，希望对你有所帮助！
作者: 随风的天使    时间: 2009-9-7 16:19

应该是你冻细胞的时候出了问题，我做培养时100mm的皿冻存六只2毫升冻存管内（含1毫升冻存细胞悬液），解冻时解冻在60mm皿中，隔天就长满了。
9 |/ l1 E5 `- [/ T' \  v8 U! i你冻存时的时间要严格把握：4度30min;-20度最少两个小时，最多过夜，主要目的是要使细胞冻实。-80可以放几周，然后放于液氮中长期保存。$ s8 A  G; {$ r* e& s' W
冻存液要混匀。
作者: yunxinxu    时间: 2009-9-16 23:02

应该是冻坏了！
作者: 大漠    时间: 2009-9-16 23:07

我觉得是冻存时出了问题，你用台盘蓝染色后看有多少活细胞。
作者: 大漠    时间: 2009-9-16 23:07

我觉得是冻存时出了问题，你用台盘蓝染色后看有多少活细胞。
作者: friendly0722    时间: 2009-10-28 19:05

我也遇到这个问题，经过分析有两种原因，一是你冻存过程中的问题，例如冻存液，冻存时的细胞状态，还有就是你在冻存过程中是否细胞有时候没有在液氮中浸没（我的问题在这里），二是你冻存细胞的密度。估计以后你解冻同一批时候也有这样的问题，如果试验比较重要，最好抓紧时间重新做一批MEF。
作者: yaner    时间: 2009-11-23 19:01

最好离心，去除冻存液后在过夜贴壁，因为DMSO在高温下会影响细胞的存活
作者: nmnannan    时间: 2009-11-24 14:40

感谢大家关注，并给予意见和建议！确实是冻存或者运输的原因，这批细胞是我购买的，复苏后都不贴壁，后来要求卖家再寄来一批，结果就好了！谢谢大家！
作者: 认真    时间: 2009-12-11 16:12

不知道是不是因为复苏后没有离心的关系?
作者: he_liang    时间: 2009-12-11 16:14

你的冻存液有没有问题啊？始终觉得就是冻存时的处理不当造成的，或者说，冻的时候细胞原本就不好？还有你的冻存方法也可能有影响
作者: sacia    时间: 2009-12-12 17:22

个人觉得，应该是冷冻的细胞状态不好所致，要是细胞状态好的话，很容易养的，MEF贴壁能力挺强的。
作者: jsy    时间: 2010-3-26 20:24

冻存管37度水浴后直接加入到5ml的完全培养液中培养吗？那冻存液不是还残留在培养体系里？可以尝试在用DMEM稀释冻存液后离心弃上清，然后再用新鲜培养液重悬接种。此外，毫无贴壁细胞极有可能是你冻存时出了问题。冻存一定要迅速。
作者: ssuwhite    时间: 2010-4-2 16:49

复苏后不必非要离心吧
作者: sniper    时间: 2010-4-10 16:32

解冻后计一下数，在用tunel染色看一下是不是细胞出问题了
作者: yezi_830823    时间: 2010-4-19 20:06

我也有这样的问题
作者: sniper    时间: 2010-9-26 18:46

我最近也遇到同样的问题了，我感觉有可能是细胞冻存时出现了问题；再有就是培养基的更换；至于你的问题可能和我不太一样，看看是否培养条件发生了变化，比如说co2，温度，是不是培养箱污染了等等
作者: zhbshi998    时间: 2010-9-27 21:52

MEF细胞复苏的时候动作要迅速，因为解冻后的常温下DMSO对细胞是有伤害的；还有就是原代细胞冻存后存活率相对低，所以冻存的时候细胞密度需要稍大一些至少10^6/ml冻存密度；另外有时候复苏不好很可能是冻存的时候就出了问题，所以啊这个原因是多方面的，自己仔细找找吧，祝你好运！
作者: taoli10000    时间: 2010-12-14 14:20

现在遇到同样的问题，请问楼主你找到解决方法没？传授一下下，谢谢。。。



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