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标题: 骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导（转贴精华） [打印本页]

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:50 标题: 骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导（转贴精华）

本帖最后由 chailh 于 2009-6-30 08:57 编辑
; @3 E" o& [ E
骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导方案是什么，哪位大侠帮忙一下。
谢谢。

本贴回复转贴自dxy的精华贴

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:50

1.常用的体外诱导方法是在体外培养的成体干细胞中加人入诱导因子。诱导因子包括各种能影响细胞分化的物质，如血清、糖分、维生素、以及各种蛋白因子等。
2.日本学者Oh等首先报道，高浓度肝细胞生长因子(HGF)体外诱导大鼠骨髓细胞分化为肝细胞，并表达CK8, CK18, ALB等。
3.2002年，Schwartz等将大鼠、小鼠和人的多能成体前体细胞(MAPC)接种到铺有基质明胶或纤维连结素的培养瓶中，用60％DMEM(低糖型)+ 2% FCS培养体系培养，并加入HGF和/或成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)，在培养的第7天，MAPC分化为表达肝细胞核因子-3BETA,GATA-4 ,CK-19和AFP的上皮样细胞，在第14-28天，这些上皮样细胞表达CK-18, HNF-4和HNF-1 alfa。大约在第21天，CK-18和ALB染色阳性。这些上皮样细胞也具有肝细胞功能特征:分泌尿素和白蛋白，能摄取低密度脂蛋白并贮存糖原。
4.结果表明，用HGF和FGF-4在体外能将MAPC诱导分化成具有形态、表型和功能特征的肝细胞。实验表明，FGF-4单用可诱导肝细胞分化，用HGF处理的细胞分化程度更高。

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:50

查过一些文献，诱导方案不一，大是大都是HGF,FGF,EGF这三种主要成分，加入的量和时间不同，有人设计出一种cocktail的诱导方案，也有人直接将所有因子加入诱导，真是不知道怎样评价那种方案好，哪种不好。
附上1篇文献关于诱导的。不知道为什么老说文件不存在。

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:50

昨天试用了一种诱导方案诱导（向肝细胞），今天去看，细胞死了70％，全部悬浮起来，自己一想，MSC在变为肝细胞时需要时间，此时将适合MSC的DMEM换成适合肝细胞生长的诱导培养基应该是对MSC有影响的，应该采取逐步替代换液可能会好点，可是这种方法是别人用过的成功的方法，为什么他们就没有出现过这种情况，还是本身方法没问题，是我的实验出了问题呢？

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:51

1.请问您的MSCs是培养多长时间的，您什么时候换成肝细胞诱导液进行培养的
2.一般说来，培养3-5代，待细胞融合80％左右，细胞活性很好，此时添加诱导剂较好
3.诱导液的配制方法，已经诱导液的pH，pH值直接关系到细胞的存亡，一般说来，无菌基本不是问题- c4 _. F) C, d2 K. x# Y
4.一般无需逐步替代换液. |, E$ T5 e' D) l6 w$ ]0 C
5.应该不是您方法的问题，能把您诱导的具体方法发上来一起研究就可以更好的找出原因了，试验要尽量注意小细节问题！) ]8 O1 `% K( m4 }3 B
祝你好运！

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:51

我使用HGF20ng/ml，EGF10ng/ml联合诱导，10％FBS（Gibico特级胎牛血清），24小时后，一半细胞漂浮，48小时细胞死掉大半，镜下几乎不见典型贴壁细胞，真是心痛。
疑问：
1、细胞活性不好？; l; G' ]* e! J* I* ]$ J
代数是第4代，诱导前感觉形态尚可，密度为约70％
有人认为，诱导需要低营养、高细胞密度的条件，不知对不对？？
2、诱导方案有问题？
各位有没有什么推荐？感觉上，很多国内文献的因子诱导方案似乎有待考证% ? c' I* k3 }8 c# p
初生牛犊，期待各位前辈的指点！
图片我迟些时候上传上来。

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:51

1.您的细胞活性应该不是大问题，可能出在诱导培养液上
2.诱导需要低营养、高细胞密度的条件，有一定的依据，很多人也是这样做得，效果还不错: g* J# D1 n! L( _+ ?$ J
3.诱导液的pH值有一定的要求，一般要在7.2-7.4之间，配好溶液时测定，然后过滤除菌，最后取一部分加相应的因子就行了，4℃下保存的培养液保存最好不要1个月4 R2 b3 W6 z. d/ o
4.您的诱导方案上基本没什么大问题，再试试吧

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:51

谢谢xn8476！
我用的HGF/EGF储存液错误放在4度冰箱一月余，会不会跟这个有关阿，痛苦啊，一千多的东西，一时错失就.......呜呜7 S3 @1 H: b2 k: B- g1 S3 A+ Y# N
今天观察细胞：诱导第4天，细胞稀稀落落的，没有明显增多，宽大、分支多，还见到很多串珠、片状圆形半透亮的东西，是不是感染支原体之类？图片还要等几天啊，拍照和培养不同地方。

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:51

我用的方案是：: b2 r+ M, Z# g
1 取第五代90％融合细胞
2诱导培养基：HeptoZYMEZ－SFM＋HGF 20ng/ml+FGF-4 20ng/ml+EGF 20ng/ml
诱导24小时，细胞死了70％，48小时死的七七八八。
可是师兄做出来很好的，不知道什么原因。

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:51

请问ctyw708
您是在原先的基础培养基－－DMEM上加入诱导因子吗？

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:52

HeptoZYMEZ－SFM是什么？
我用的是10％的FBS,DMEM/F12加上诱导因子
之前用于第五代细胞，几乎没有死亡，但形态变化不大& n5 P: c# k: I4 m* \$ I
这次改用第四代的，融合70％，可能因为密度偏低，或者因子活性降低，或者细胞活性不好，死亡明显
请问您是什么动物实验？

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:52

HeptoZYMEZ－SFM是一种肝细胞培养基。4 t% R; a& Z/ V* ~
我现在不是做动物实验。
用DMEM加诱导因子，应该MSC还会长的阿，我用90％融合的细胞诱导，发现它还是长，过几天，细胞没诱导出来，反而是MSC长成100％，还重叠了，很难观察，我还想用80％左右融合的细胞诱导呢。

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:52

我的意思是您是大鼠还是兔子还是人的MSCs?
加药后细胞不会漂浮一部分么？, ]4 |- c1 G" U, x' Q5 U
有人加入的塞米松和胰岛素，不知效果如何

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:52

我的是人的MSC。
我之前用逐步替代，即：用完全诱导培养基(见上)逐渐替代DMEM。未见有细胞漂浮，今天全部改用了诱导培养基，看看明天怎么样。

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:52

附上一篇诱导方案，可是觉得很复杂，所以暂时没有采用，多了几个因子，就是大把钱啊。还是找了个简单的，可是效果不好，是否这种阶梯型的诱导真的很好呢，为什么要这样逐步加入因子呢？

Hepatic differentiation protocol5 C) [- m' @$ Z. g: b
Passage 2 BMSC and ADSC cultures at 85% confl uency' r+ t! |( X2 _9 Y7 n' A( j0 {
were used for differentiation assays. Cells were serum3 C; Y* q( ]7 `- U) K/ Q
deprived for 2 d and pre-cultured in DMEM supplemented* N( W8 Y' M) U; E
with 20 ng/mL EGF and 10 ng/mL bFGF (conditioning
step) to stop cell proliferation, prior to induction of
differentiation toward a hepatic phenotype. Then a 2-step) ^3 R% B6 G9 u% G1 j; `4 ^
differentiation protocol was performed, followed by
a sequential addition of growth factors, cytokines and# y5 u. p. f; G8 R5 Q
hormones (Figure 1). Step-1 differentiation medium,
consisting of DMEM supplemented with 20 ng/mL HGF,
10 ng/mL bFGF and nicotinamide 4.9 mmol/L, for 71 z8 T K8 _% t6 d) J
d, followed by step-2 differentiation medium, consisting
of DMEM supplemented with 20 ng/mL OMS, 1
μmol/L dexamethasone, and 10 μL/mL ITS + premix
(final concentration: 100 μmol/L insulin, 6.25 μg/mL4 z9 Y4 m/ s% m* y+ e
transferrin, 3.6 μmol/L selenious acid, 1.25 mg/mL BSA) Y. K {2 I# r# }4 O8 L
and 190 μmol/L linoleic acid) to achieve cell maturation
up to D21. Media were changed twice weekly and hepatic$ {/ r4 h' b# o# L) H
differentiation was assessed at different time points by RTPCR
for liver-associated genes, as listed in Table 1. The
protocol was applied to BMSC and ADSC from fi ve and
six different donors, respectively, and identical results were, g8 X7 f' q& V) [& _& V
obtained.& |8 O1 m; M$ q. q# S" e. ~) }
－－－World J Gastroenterol 2006 September 28; 12(36): 5834-5845

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:52

我的细胞似乎形态有些变化了。
不知道那些因子加在培养基里面，能够保存多长的有效时间呢。
有人主张现配现用，不知道是不是有必要啊。
明天去拍个照给大伙帮忙看看是不是真的变了。：）

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:53

happydazy:
大概知道你是谁，那么你也应该知道我是谁，呵呵。在我的试验中，HeptoZYMEZ－SFM的诱导确实容易出现细胞漂浮和脱落，只有两次效果比较好（可是非常不好意思，我忘记当时有没有加血清了），我感觉要么加血清增加营养，或者按照何念海等人的方案，加用增加贴壁的基质明胶或纤维连结素（铺底）。同时采用普通胎牛血清配制的诱导培养液的成功率似乎还高些（但是速度和蛋白分泌的水平好像比不上HeptoZYMEZ－SFM的诱导培养液）。我建议你可以先用普通胎牛血清配制的诱导培养液试试，但是形态方面我总是无法达到国内外文献上报道的那么好。只是mRNA的检测最满意。你现在的逐步更换培养液也是一个办法，向你学习！（有空时，现在走不开，太忙，在临床）

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:53

大家认为国内形形式式的诱导方案可行性（可信度）如何？？$ x5 }0 t1 o9 ~* w: K% f
培养细胞好几批了，用的是进口的诱导因子和血清，细胞就是没有文献说的那样肝样细胞典型形态和标志物表达（AFP/ALB），郁闷，抑或自己的水平问题$ K- p# ~# G, x' U0 F
呜呜/////////

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:53

诱导实验!一个注意别人文献报道的干细胞的特征!而你所培养的干细胞是什么特征!这个是基础前提!需要明确的!. v' s* ]5 r. K9 J
二就是所采用的诱导方案具体是如何给予的比如给予干预的细胞代次,给予干预的时间\浓度\诱导剂的来源公司等.

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:53

有篇外文文章涉及诱导方案，要者就顶：Chromatin remodeling agent trichostatin A: a key-factor in the　hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells derived of　adult bone marrow。6 J- Q) i0 Y' {% _/ `( \# R: d
; i$ L* u0 q9 T7 H
Abstract+ H4 E7 @0 N! U7 ^8 ?
Background: The capability of human mesenchymal stem cells (hMSC) derived of adult bone
marrow to undergo in vitro hepatic differentiation was investigated.
Results: Exposure of hMSC to a cocktail of hepatogenic factors [(fibroblast growth factor-4 (FGF-
4), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-transferrin-sodium-selenite (ITS) and dexamethasone)]
failed to induce hepatic differentiation. Sequential exposure to these factors (FGF-4, followed by" z" `( ~ [4 ^ C' R
HGF, followed by HGF+ITS+dexamethasone), however, resembling the order of secretion during
liver embryogenesis, induced both glycogen-storage and cytokeratin (CK)18 expression. Additional
exposure of the cells to trichostatin A (TSA) considerably improved endodermal differentiation, as3 g' y/ d0 L9 g1 J* A& k9 z
evidenced by acquisition of an epithelial morphology, chronological expression of hepatic proteins,
including hepatocyte-nuclear factor (HNF)-3β, alpha-fetoprotein (AFP), CK18, albumin (AL,
HNF1α, multidrug resistance-associated protein (MRP)2 and CCAAT-enhancer binding protein6 S# }0 z J0 I5 G* v% k
(C/EBP)α, and functional maturation, i.e. upregulated ALB secretion, urea production and inducible
cytochrome P450 (CYP)-dependent activity.* W6 ~0 A7 ~% H
Conclusion: hMSC are able to undergo mesenchymal-to-epithelial transition. TSA is hereby* X. A( ~6 H1 x) K( X( D
essential to promote differentiation of hMSC towards functional hepatocyte-like cells.

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:53

你诱导期间，有没有每3天给细胞换液一次？

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:53

能够使多能成体前体细胞(MAPC)诱导为肝细胞的方法，同样在MSC也行吗

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:54

1 诱导期间,每3天换液一次.; g+ w/ p* U0 ]
2 起初我觉得形态改变的细胞,经过师兄鉴定,认为不是,而且细胞可能死亡了.' V( J% D5 W" M; h& X
3 看了很多文献,觉得人家似乎轻而易举就诱导出来了,单用我用的那种肝细胞培养基,或者加一些上面提到得因子,可是我自己做出来就不是那么简单了,至今也没有明显得形态改变.但是众多得实验所附代得图片我觉得并不是很好,因为一般都是长至80%以上诱导,可是给出的照片却只有几个细胞(也有改变了倍数的),让人无法从整体上面对比诱导前后的样子,我是有点表示怀疑的.
4 接下来我想试着改变一下方案,使用胶原铺底;在细胞消化传代的同时加入诱导剂;尽管没有形态改变,我也准备进行基因表达的鉴定.

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:54

你用的是哪篇文献的方法啊？我查到3篇国际消化学杂志的文献，不知是否可靠？

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:54

我没有借鉴一个特定的文献报告的方法,分析几个方法,自己归结了一下的,主要是用师兄的方法,他是诱导成功的.里面的3个因子都是一样的.

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:54

有哪位朋友用过HGF和制瘤素诱导MSC向肝细胞分化，不知具体步骤是什么？

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:55

有没有用损伤肝组织匀浆和血清诱导干细胞向肝细胞分化的啊/?
我的实验室很穷,什么都不给买

作者: chailh 时间: 2009-6-30 08:55

我有师兄用过这个方法,好像挺好的,但是我自己一用就不行了,可以试一下啊.
唉,诱导的细胞很不好,即使用一型胶原或者鼠尾胶铺底还是不能解决问题.细胞在诱导第7天就死了,很干枯那种,只有细胞骨架了.不知道什么原因.
很是郁闷啊.

作者: gonghuibin 时间: 2009-7-22 22:12

大家好，我目前正在做这方面的实验
前期也做过一次，失败了，是在细胞诱导的第七天，细胞就死了，也是很干枯的那种。找到以前做过这方面的老师请教，我用的是10%的血清，说是细胞长的太快，缺乏营养。让我刚开始就用低浓度的血清。我自己也怀疑，会不会漂起来。我的QQ279099294: y1 O" p+ }3 V {
希望大家多多交流

作者: wenfeng8212 时间: 2009-7-25 23:02

感谢感谢，下下来学习了

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