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标题: CIK培养时，国产细胞因子浓度要增加么？ [打印本页]

作者: lybai 时间: 2017-4-19 09:17 标题: CIK培养时，国产细胞因子浓度要增加么？

目前我们做CIK培养时，用的国产细胞因子，干扰素为1000U/ml, OKT3为50ng/ml. IL-2为500U/ml, 效果不好，数量级达不到，请问国产因子浓度需要加大么？

作者: 阿秀哥 时间: 2017-4-19 09:52

我们IL-2是1000U/ml，效果还行，楼主可以试试，仅供参考，希望对你有用

作者: lyj-0017 时间: 2017-4-19 11:15

回复 lybai 的帖子$ P, ]% |% z- n
6 d* q8 T" C" n
可以把你大体的操作流程发一下让大家帮你分析一下，单纯这样说看不出为啥数量级达不到的原因。

作者: lybai 时间: 2017-4-19 14:47

回复 lyj-0017 的帖子- L; j: P; d M" `: ~
1 g2 Y# }3 M6 }5 x
抽了20ml正常人的血，分离出PBMC，分完能看到明显红细胞。) f( r1 ~7 B5 B }5 ]! f' d
第0天：接种浓度1.1*10的6次方/ml, 用Gibco AIM-V培养基25ml，接种时加入了伽马干扰素，- c3 K( n! p: _) A0 k+ Q
第1天加入CD3，IL-2，浓度如第一个帖子，
第3天，培养基颜色变化不大，计数为3*10的6次方，补液25ml,添加IL-2
第8天，培养基颜色变黄，计数3.7*10的6次方，补液50ml,添加IL-2.3 L+ L1 j* W2 U- X6 Q
第10天，颜色稍微变黄，计数6*10的6次方，补液100ml,添加IL-2" |- Q. I3 g: g- U
第13天，培养液颜色没什么变化，计数1.8*10的6次方，

作者: lybai 时间: 2017-4-19 14:58

第0天还加入了1%的自体灭火血浆，忘记说了

作者: rzghc 时间: 2017-4-19 15:09

新因子可以做一下不同因子浓度的预实验，确定最佳范围

作者: lybai 时间: 2017-4-19 15:20

回复阿秀哥的帖子
3 e! M5 g C, Y
谢谢您提供经验。

作者: wzs1985 时间: 2017-4-19 15:51

各种因子的活力是一种ED50的即半价有效量。各个公司的因子活力不同，有个半价有效量是1ng/ml，而有的可能是0.2ng/ml。所以你要根据这个半价有效量来调整你所添加的因子浓度。

作者: lybai 时间: 2017-4-19 16:20

回复 wzs1985 的帖子 I% L# w: f: J; m1 d3 r+ H
7 n: K m, r; j! X. X
这个ED50需要自己测吗？没看到购买的CD3单抗上有标注ED50，其它因子直接标注了活性如10*7IU/mg,培养时，我看只有CD3单抗用的单位是ng/ml,其它都是活性单位IU/ml,这个已经是活性单位了，还要换算么？

作者: lyj-0017 时间: 2017-4-19 17:59

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因子浓度没啥问题，第三天补液太多了，细胞还没开始大量扩增你就稀释一倍。

作者: Ivan0108 时间: 2017-4-20 13:03

1、个人认为不需要用重量单位来计算加入量。最好是购买国产因子时问清楚活性是多少，按照进口因子的活性值，通过活性值反过来推算国产因子加入重量。* J9 k a; C/ M2 q4 S
2、看你的因子培养基加入，有点问题。 CIK细胞需要诱导激活期密度大一点。所以你第0天20ml血分离的PBMC接种25ml培养基肯定多了点建议改成10-15ml。

作者: lybai 时间: 2017-4-20 14:27

回复 Ivan0108 的帖子4 S2 q- m: `& }( }. l+ `" Z2 k

接种密度需要控制在多少比较合适？还有一个不太明白，伽马干扰素和IL-2加入时都是按照活性单位来计算加入量，为什么CD3单抗却是按浓度单位ng/ml算加入量。

作者: 孤独山石 时间: 2017-4-21 10:09

楼主的因子浓度差不多没啥大问题。我个人觉得您前期补液太少了，这个CIK第三天后高速扩增，1：1补液根本不够，不知道您有没有注意补完液第二天培养液是不是已经变黄，培养液营养不足，PH偏酸可能是导致您细胞数量级不够的原因。个人建议前10天控制补液后细胞浓度0.5-1*10的6次方，这样细胞扩增较多，活性也较高。

作者: wzs1985 时间: 2017-4-21 10:15

回复 lybai 的帖子8 j# m- y% f2 p% x" z2 `; S& a

ED50不用自己测定的，一般进口因子都是有标注。就像thermo的ED50都是一个范围值https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10704H02H50?ICID=search-product。所以你说不定要变动下添加的浓度。
另外，il-2已经出了国产药品，可以直接购买。$ L; r4 ^9 |, O% G7 Z( U
Gibco AIM-V虽然是无血清培养基，估计还得的少量加些。

作者: 淘知路遥 时间: 2017-4-25 16:41

个人感觉接种密度少了，20ml血液提取的细胞加了25ml培养液，下次可以增加血量50-60ml，或者改用T75瓶培养，同时培养液减半

作者: 淘知路遥 时间: 2017-4-25 16:45

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说明书有ED50,和换算单位的，看你用什么液体稀释的

作者: 剡溪兰客 时间: 2017-4-26 14:01

自己摸一下条件，浓度太高会提早凋亡的，大概7天左右

作者: baoweih 时间: 2017-5-3 17:01

回复 lybai 的帖子4 Q" N3 z/ [0 J
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你好，能问下CD3是怎么加的吗？你说CD3浓度是50ng/ml,第一天加CD3，是按你接种25ML的量来配成50ng/m吗？谢谢

作者: lybai 时间: 2017-5-4 09:38

回复 baoweih 的帖子' R O7 ^/ v' @* T: c

是的，终浓度是50ng/ml

作者: baoweih 时间: 2017-5-4 13:21

回复 lybai 的帖子8 L6 t& _5 W+ d) [) A1 w( f# C, B

是加这一次吗，后面的培养不用加了吧。我这是用10ML培养基包瓶加20UL的因子，我知那是CD3，但不知道浓度

作者: lybai 时间: 2017-5-4 14:16

回复 baoweih 的帖子

包被一般就不用加游离的了，

作者: cheeray 时间: 2017-5-10 09:54

il2 增加一倍

作者: 沙漠狐o0 时间: 2017-5-20 11:24

1.初始细胞浓度低了，最好不要低于2*10^6/mL;
2.国产因子IL-2 500U/mL是可以的，也可以试一下1000U/mL；CD3可以试一下100ng/mL。

作者: zmfang555 时间: 2017-5-24 08:26

不知道你分完PBMC红细胞多不多，计数时有没有加红细胞裂解液，如果红细胞太多的话，会影响计数的准确性，造成铺板的PBMC密度不够，也会对其扩增产生很大影响的。

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