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标题: 成脂诱导剂的具体配法!（非常详细） [打印本页]

作者: adonis 时间: 2009-8-4 11:59 标题: 成脂诱导剂的具体配法!（非常详细）

做实验，菜鸟一只，谁能指点一下成脂诱导剂具体怎么配呢？郁闷啊 0 G$ n# s- O" Z# W; `
* b' l1 O( U1 h; `1 q2 U
本贴为转贴精华

作者: adonis 时间: 2009-8-4 11:59

诱导脂肪体系
1．5 L* _) t0 G# r+ ]' @
试剂溶剂终浓度储存浓 1ml体系加量8 I8 O" }5 B' M
Dex  去离子水    1μM 1mM 1μL9 b% P% r3 J( V; b+ ], t
消炎痛  甲醇 200μM 40mM 5μL / K4 I- m; l$ N" S2 D& `
IBMX3-异丁基-1-甲基黄嘌呤  DMSO  0.5mM 50mM 10μL
胰岛素  2M盐酸 10μg/ml 5mg/ml 2μL
- ~% O, j2 g3 k
2．DMEM（HG）和10%FBS。
3．3代以上细胞，24孔板每孔105个细胞，六孔板每孔104个细胞，每三天半量换液，共诱导2周。

作者: adonis 时间: 2009-8-4 11:59

谢谢楼上!但能不能再说具体点，盐酸是百分之几的呢？

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:00

以下是本人在综合园子里的各方经验，阅读Sigma的说明书，考虑实际操作需要上总结的。注意各个文献所使用的试剂的实际浓度有出入和计算单位有不同，另注意溶剂的浓度和对实验的影响。/ N( d! x$ m& t1 P4 @& B: M2 E

材料：DMSO 2N盐酸（此时大多数人的答案，N 是克当量) 无水乙醇
消毒好的1毫升EP管微量加样器消毒好的小青瓶   M$ v8 U& t" r3 P
消毒好的一次性小滤器，有机系滤膜（消毒前放入滤器一起高压消毒，本人使用尼龙膜），也可以购买一次性的有机系小滤器
一次性5毫升注射器电子天平2 Z  L5 g* ^7 ?( C( ^# u  G

胰岛素干粉： 2mg加1ml水(盐酸调节水为PH 2.0)( 此为说明书所写），保存温度：-20度。0 y/ r  r% F2 Z+ Z
1.10mg溶于5ml pH2.0的盐酸溶液，浓度为2mg/ml。过滤。
2.分为20份，每份0.25ml含0.5mg，分装在EP管里，保存在-20度。
3.取2份即1mg加入100毫升培养基里，终浓度为10mg/ml。（盐酸为0.5ml.本人已证明对100毫升pH 为7.4的培养基的pH不会有明显影响）) h. z9 g) s/ Z' `1 X9 P

非水溶性地塞米松干粉（分子量为392.5）：保存在2-8度，在无水乙醇中不需加热溶解度是25 mg/mL 。, b5 c. |. X: y8 A  A  A
1.电子天平称取3.925mg溶于5ml 无水乙醇，浓度为0.785mg /ml=2mMol/L。过滤。
2.分为100份，每份50微升含0.03925mg，分装20份（余下的使用前再分），保存在-20度。1 X9 y* y. z* _) T
3.取1份即0.03925mg加入100毫升培养基，即终浓度为1M。（无水乙醇为50微升）如果是水溶性的则方便。$ P6 l7 ^( @2 @3 L" x4 I9 D' ]: W% ?

IBMX干粉：保存在-20度，在室温下也是稳定的。It is soluble in 100%DMSO at 1 M with gentle warming.+ W0 T  d* p9 e3 n0 H. x/ y
1.99.9mg（实际包装是100毫克，故是100毫克）溶于2.7ml DMSO中，浓度为55.5mg/ml，过滤。' m9 q- O! R; O. V. Z; X
2.分为18份，每份为150微升含5.55mg。保存在-20度。
3.取2份即11.1mg加入100毫升培养基，终浓度为0.5毫摩尔/L。（DMSO为300微升。可惜稍微多了点。）
& h; V1 u8 n1 }  T( I5 G# p! O$ ~) q
以上三种同时加入到100毫升的培养基内，配好的诱导培养基如果短期内用不完，同理分装冷冻。! p; q- s, _* v3 ^
本人全部过滤，考虑到在称取试剂时很难无菌操作，进口分装试剂本身和溶剂本身的无菌状态难以肯定。但过滤时滤器会损耗溶液。
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请使用前阅读Sigma的说明书。个人操作共同分享，恐有不当，仅供参考。

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:00

1.3.取2份即1mg加入100毫升培养基里，终浓度为10微克/ml。（盐酸为0.5ml.本人已证明对100毫升pH 为7.4的培养基的pH不会有明显影响）
2.3.取1份即0.03925mg加入100毫升培养基，即终浓度为1微摩尔/L 。（无水乙醇为50微升）如果是水溶性的则方便。

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由于复制时有错误，已改正。

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:00

还想请教楼上师兄一个问题：在有些文献中诱导剂中除了以上三种药物还有消炎痛，请问两种的效果会不会有区别？

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:05

个人没有比较过。文献上报道用三种也可以诱导。此外StemCell Technologies Inc.公司有专门的诱导培养基Product Name: Adipogenic Stimulatory Supplements (Human)。Catalog Number是: 05403，有兴趣可以看看。至于各种诱导成分的具体的作用过程，提供给你一些文献，希望有用。有没有区别可能我回答不了。

脂肪细胞的分化及调控.pdf (178.36 KB)

ecular regulation of adipocyte differentiation.pdf (236.16 KB)

附件: 脂肪细胞的分化及调控.pdf (2009-8-4 12:03, 178.36 KB) / 下载次数 84
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MTczNnw3OGQ5MjY0MXwxNzkzNjg5NzkxfDA%3D

附件: ecular regulation of adipocyte differentiation.pdf (2009-8-4 12:04, 236.16 KB) / 下载次数 61
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MTczN3wzZTEwZmU5YnwxNzkzNjg5NzkxfDA%3D

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:05

谢谢柳叶刀师兄!!终于可以开始配制了!9 o) {" f! W- [" T9 H0 S0 I
呃，还想问个问题，你做过油红O染色没？我现在要准备做油红O染色，可是不知道异丙醇要用什么浓度的(有说用60%的)；没有10%的甲醛，可以用95%的酒精代替吗？

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:05

师兄你好!上次多谢你告诉我怎么配成脂!现在四种药都到齐了可以开始配了，可是又遇到一难题，胰岛素溶解不了~~黑线~我把36%的盐酸稀释了10倍也溶不了--|||--我没有PH仪，所以也测不了盐酸是不是PH=2，所以现在实在是~~~痛苦啊~~~师兄可否拔冗指点一二？多谢!

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:05

请问你的胰岛素是哪个公司的哪个货号啊。sigma的说明书对胰岛素在pH2.0盐酸中的溶解度有清楚说明。不能溶解是否保存不当的原因？! R5 r2 H* ?$ C" C- l7 m
如果没有PH仪，还真的比较棘手，盐酸的pH跟温度，浓度，稀释剂都有点关系。得问化学的人。# ^. C2 |& Q8 ?$ C
个人认为这里作为溶剂的盐酸只要ph在大概的范围就可以了，只会导致溶解度的波动，尝试用“精密”试纸看看。最好是未开封的。

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:05

我买的是sigma的。今天下午我又溶了些，1ml36%的盐酸加了0.6ml的纯水，慢慢的加，看到溶解了再加纯水，可是又遇到问题了，气死了

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:06

我买的是sigma的。今天下午我又溶了些，1ml36%的盐酸加了0.6ml的纯水，慢慢的加，看到溶解了再加纯水，可是又遇到问题了，气死了

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:06

1．测pH时所用不同浓度酸、碱稀溶液的配制： 4 Q2 U6 v3 h6 ^$ v1 v
8.4mL的浓盐酸加水稀释至1L，浓度为0.1mol/L，其pH为1．取0.1mol/L的盐酸1mL加蒸馏水到10mL，它的pH为2．取pH为2的盐酸1mL加蒸馏水稀释到10mL，它的pH为3，照此逐一稀释，能配制pH为2、3、4、5、6的酸溶液。 4 q( h# t3 T4 X& t2 `
同上法，0.1mol/L氢氧化钠溶液的pH为13，稀释10倍后pH为12，逐一稀释，能配得pH为11、10、9、8的碱溶液。 ) v! Z# }+ c' v3 w+ b
2．用pH试纸测定溶液pH的操作　 , \& Y* F* H1 b
用玻璃棒蘸取待测溶液，把它滴在pH试纸上。把显示的颜色跟标准比色卡对照，读出相同颜色的范围。不能直接把pH试纸浸入待测的溶液中，以免带入杂质，同时这种操作还可能泡掉pH试纸上的一部分指示剂，致使比色发生较大误差。 5 f* h4 s+ ~2 \ w: Q9 V) E
---------- k$ w* `' P* C$ M! \0 ~3 l" y
此处温度应该是室温，浓盐酸应该是分析纯的试剂7 ]* Q5 W8 |% d) Q$ Z- G2 Z
胰岛素在pH2.0的盐酸溶液中很好溶解的。

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:06

最近看到几个战友配制脂肪诱导剂也同样和我经历了很多棘手的问题。这些小问题，有时候造成大麻烦。说说我的一些不成熟想法。
1.首先确定各组分的浓度，各文献报道不一，并且有的还存在错误。所以最好根据权威文献来计算。我上面的回帖胰岛素用10微克/毫升，在我的实验中效果并不是很好。实际上大多数是10微摩尔/毫升。
2.确定浓度后，理论上成脂肪诱导是很成熟的方案。但觉得还是要做好调整浓度的准备。就是比如对于胰岛素，地塞米松这样的活性物质，每个厂家，每个批次的产品，质量与“比活性”，或许有出入吧，所以实验室老师也建议，要做几个浓度梯度。比如胰岛素就准备了5毫摩尔，10毫摩尔，15毫摩尔的浓度。

故配制的时候，就每份分装为500毫摩尔----够加入100毫升培养基。
如果打算做最高浓度为15毫摩尔，那么就要加三份分装好的，----这里的总共的盐酸对于培养基pH影响就要去测试。----由此估算母液要多少浓度
3 o+ @6 H# G* }. S
因为要过滤，浓度又不能太高导致母液总量小，会损耗太多。也有的人先加入培养基再一起过滤，这是另一种方法，但还是要先用特定溶剂溶解好再加入。1 D0 M1 z$ s* A! x

对于要不要过滤，有战友提出争议，在超净台内称量的话，对于未开封的非分装的试剂是否是无菌的呢？有人说可以，有位版主认为不行。如果不需要过滤那可是很好的，母液尽可以配浓一点。 , E+ g1 O9 _. G1 |  ?: I
我怕万一污染都一一过滤，感觉那个小滤器过5毫升就损失了0.5毫升。1 q" X7 o# O: k% H+ Y
8 R+ w. G$ C0 v( v5 q% m7 ], I
2.对于溶剂的浓度对实验的影响，一直没有找到权威说法。希望有战友提供。---对这里的实验而言。6 S0 z" j! L3 m4 q6 [' Y% T* w

3.关于用临床用的药物的问题。经总结如下：
胰岛素：" r/ T3 E$ y6 a3 i( _5 i
胰岛素种类：5 P- @; z- X8 a0 f
按来源：1、动物胰岛素：
短效胰岛素（普通胰岛素）：400单位/支' Z7 d' ]5 \+ K* F$ u1 O6 z5 ^
长效胰岛素（鱼精蛋白锌胰岛素）：400单位/支
人胰岛素：分为二个厂家生产：
美国礼来公司…………优泌林
丹麦诺和诺德公司……诺和灵; N4 ?1 c1 z  \" a4 C2 Q" s* w' g. i
优泌林：8 t2 X% |6 ]) d* f8 I' b4 |
瓶装剂型：400单位/支，
常规优泌林（短效）) _% M- A# C1 H6 H* ~
中效优泌林（中效）0 H5 g9 G3 S$ T4 t
优泌林70/30（预混30％短效、70％中效）3 x3 {3 ?2 X/ f) _# [. R: Z, P
诺和灵：
瓶装剂型：400单位/支，
诺和灵R(短效)
诺和灵N（中效）
) ^+ `3 G( e& k2 m
有人认为可以使用临床的，但至少国外文献很少见到用临床药物的。7 x+ P9 F# G" t0 b+ y2 @" v" M; O
关于质量单位和国际单位的换算：战友提供& |8 I' x& P# ?9 p; E
有些药物如维生素、激素、抗生素、抗毒素类生物制品等，它们的化学成分不恒定或至今还不能用理化方法检定其质量规格，往往采用生物实验方法并与标准品加以比较来检定其效价。通过这种生物检定，具有一定生物效能的最小效价单元就叫"单位"(U)；经由国际协商规定出的标准单位，称为"国际单位"(IU)。国际标准品主要是供给各国来建立和标化自己的国家标准品。对于还没有建立国际标准品的药物可以由本国制订国家标准品。 ; Q3 i  H9 J1 J% ^8 q
一个"单位"或一个"国际单位"可以有其相应的重量，但有时也较难确定。单位与重量的换算在不同的药物是各不相同的。1931年国际联盟卫生组织的维生素委员会，首先规定了各种维生素的国际单位；如每1个国际单位的维生素A相当于0.3微克，若是它的乙酸盐则为0.344微克，维生素P相当于O.025微克，维生素E相当于1毫克等等。虽然许***生素现今已改为重量表示，但维生素A和D仍然沿用国际单位。 , v7 J8 z# Q3 F) v' G$ q. p9 k
各种激素1国际单位折合国际标准制剂的重量为：黄体酮1毫克、绒毛膜促性腺素O.1毫克、垂体后叶激素0.5毫克、催乳激素0.1毫克、胰岛素45.4微克。 5 ~  P1 R5 j3 ]" Q+ H
抗毒素的效价检定，通常是以能中和100单位毒素的量，作为一个抗毒素单位。
抗生素多半用单位表示其效价，随着科学研究和工业的发展，它们的化学结构也逐步明确，它们的含量可用理化检定方法表示它的有效成分的重量，所以目前也较多地采用重量表示了。
http://www.mofcom.gov.cn/article/200311/20031100142853_1.xml
中勉强有科学技术部、外经贸部、财政部、国家税务总局、海关总署关于发布2003版《中国高新技术产品出口目录》的通知
好像提到“293 30043100 重组人胰岛素原料粉白色结晶粉末，利用重组DNA技术和基因 5 技术生产胰岛素，纯度达到99％，效价> 27．5单位／毫克，主要用于治疗糖尿病。序号海关商品编号产品名称描述技术领域 294 30043100 重组人胰岛素注射液无色透明液体，利用重 DNA技术和基因 5技术生产胰岛素，纯度达到99％，效价> 27．6单位／毫克，主要用于治疗糖尿病。”& s* L- ~. N2 U  l7 {
7 K  s" m* N4 J" h" \  X5 V
另：这里所说的胰岛素是否会因生产厂家和生产工艺有所不同呢？
http://www.clinet.com.cn/download/bsb2004/69.htm) Y) p  b. h6 ^+ ~. C
一个国际单位相当于35微克（诺和诺德公司的）。

故，用试剂公司的比较省事点。

地塞米松：
临床多用地塞米松磷酸钠。很便宜。但我几乎很少看到有文献说用这个药的。
针剂地塞米松磷酸钠分子量是516.41,配制地塞米松磷酸钠1m mol/L贮存液50ml6 Z1 _% q1 ?# P, z+ V7 p8 x: A
地塞米松磷酸钠分子量:516.41, 5mg/ml (9.68X10-3mol/L )，' u6 [% b5 V+ K5 j3 S. o
计算:9.68× 10-3 × X=10-3 ×0.05，得 X =5.16m1
取9.68× 10-3mol/L的DEX 5.16ml，加灭菌蒸馏水至50ml，即得1mmol/L的地塞米松了。0 n6 x5 F! P3 e, Y. R
9 |* ]4 s& T: t# r
3.配制溶液对于经费拮据的人很重要，所以分装很重要，无论是各个配制分装还是加到培养基里，都要分装好冷冻。但是对于实际保存时间，说法不一。

4.每个人都有自己的小经验，希望能拿出来和大家分享。做各种诱导，都涉及到添加因子的配制，希望这个板块能形成一个方便实用科学的关于这个知识的帖子。还有各种生长因子的配制等等。期待战友灌水。

作者: adonis 时间: 2009-8-4 12:06

完蛋了~我的胰岛素只有不到10mg了，老板会杀了我~~~~这成脂的配得我好烦!!原料都快没了还没配出来!!不行的话只有用临床的RI看行不行了没办法了!再说这个实际保存时间了，真不知道到底是多长时间才行。买不到DEX，只好用临床上的DEX来配，也不知道到底行不行

作者: cl5823283 时间: 2009-8-7 15:36

这是我的成脂诱导液配方：一定要做到精准！; l3 C. |& d4 E& B) ]" h: q

12ml成脂诱导液：DMEM/F12（含有双抗）最后加到12ml+ 3%FBS 360ul （3次100ul+1次60ul）+ 1umol/l地塞米松120ul（用枪60ul加两次） + 5u/ml胰岛素 1.5ml（注射器抽）

作者: cl5823283 时间: 2009-8-7 15:40

8# adonis 8 t% h+ Y. g: I9 d2 M0 ?) Z

1、称0.1g油红进烧杯，加入10ml异丙醇--- 烧杯用胶袋封口（防止异丙醇挥发）---浸入60°水浴中---边浸边摇匀，10分钟。 K) E, L# O% `
2、 10ml油红+10ml双蒸水充分混合约10分钟---用滤器、滤纸过滤

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