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标题: 第三天（8月17日）中午观察细胞，并消化传代 [打印本页]

作者: 泡沫清风 时间: 2009-8-17 15:46 标题: 第三天（8月17日）中午观察细胞，并消化传代

本帖最后由泡沫清风于 2009-8-17 15:56 编辑 / B7 b" z2 L/ J5 L

第三天中午，差不多复苏后50小时左右，观察细胞
* t/ |! q* ~" f2 A5 U
4 r5 x0 U8 X5 [& \4 d4 o
不同的实验室消化传代的方法不同，我的方法可供参考：  ]8 n5 M2 G: L5 `' X1 b- ]+ w  F
9 y9 d- u4 x& ]5 J
实验前准备：" }# X: ^5 Q4 v$ {
（1）DMEM+10%FBS  d2 v( m2 ]- d* k
（2）PBS
（3）0.25%胰酶
（注：同样这些试剂要平衡到常温再做实验）9 T/ q0 M1 q) B7 Q7 P' u! F0 m

实验步骤：
（1）弃去T75瓶中的原液。
（2）加入5mlPBS洗一遍，洗去残留的血清。
（3）加入3ml胰酶，大概常温放置1-2min。
（4）加入6ml新鲜培养基中和胰酶，并轻轻吹打内壁上的细胞。
（5）将内壁上的细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大，3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧，呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧，也有人吹打5-10min。
（6）吹打成单细胞悬液后，转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。
（7）离心期间另外准备两个T75瓶，加上原瓶，共三个T75培养瓶，分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后，用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后，平均转移至三个T75瓶中。混匀。' c  {6 A; L9 g& }9 B0 k
（8）放入温箱培养。
(注：我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶，也就是1：3传。)

作者: have-a-rest 时间: 2009-8-17 17:04

有个问题，293培养基中需要添加丙酮酸（钠）吗？抗生素呢？
一点建议：胰酶里面添加一点EDTA，也许就不需要吹打那么长时间了。

作者: hualin840518 时间: 2009-8-17 18:26

good

作者: hualin840518 时间: 2009-8-17 18:28

图片是用成像系统还是相机照的？

作者: mvirus008 时间: 2009-8-17 19:12

持续关注

作者: mvirus008 时间: 2009-8-17 19:22

有个问题请教一下：! z' w! e+ Y1 S
这个细胞传代能否简化一下,(胰酶消化后直接加培养基把细胞吹散分装，省略掉离心再加新培养基再分装)，不知道这样行不行？

作者: 难得胡涂-1 时间: 2009-8-17 21:40

能不能消化后先倒掉胰酶，加培养基再吹细胞？这样也不用离心啊！

作者: 泡沫清风 时间: 2009-8-17 21:43

7# 难得胡涂-1
把问题发在疑问贴里吧，这样我不用找。我的回答请到疑问贴去看吧

作者: chenghoby 时间: 2009-8-17 21:45

好的

作者: 轩辕之客 时间: 2009-8-17 21:45

支持下！！！！

作者: sky512829 时间: 2009-8-18 00:04

学习一下谢谢分享啊

作者: cortex 时间: 2009-8-18 09:16

7# 难得胡涂-1

一般应该把胰酶去掉，否则应该对细胞有影响。胰酶消化不像dispase消化，细胞很快就起来了，如果直接去掉胰酶的话，会丢失很多细胞。: p) r2 V- K8 ^; Y) \
问一个弱弱的问题：用过的培养瓶还能用吗？

作者: biowx 时间: 2009-8-18 09:25

学习学习

作者: 泡沫清风 时间: 2009-8-18 09:27

12# cortex ( j9 K1 P6 a! s
& c n! { m; x7 R3 D: i1 O q
我们用一次性的。但上一次消化的原瓶我还用

作者: leizhongjiang 时间: 2009-8-18 10:40

虚心学习

作者: thanks 时间: 2009-8-18 12:25

看下图片

作者: joejo1124 时间: 2009-8-18 14:32

学习下

作者: wangming 时间: 2009-8-18 22:43

学习

作者: john8707 时间: 2009-8-20 14:58

关注！

作者: maz_2008 时间: 2009-8-22 08:17

作者: hcskrc 时间: 2009-8-23 02:18

h

作者: sajia 时间: 2009-8-23 13:35

谢谢

作者: jyuwang 时间: 2009-8-26 15:55

强烈支持!!!

作者: shiaiqin 时间: 2009-8-26 16:35

学习一下

作者: 02402122 时间: 2009-8-27 08:48

吹打这么50-100次
原来我的吹打太少

作者: dylm2000 时间: 2009-8-27 18:23

学习学习

作者: fishbirth 时间: 2009-8-29 02:42

顶你非常好

作者: jamesbrady110 时间: 2009-8-29 14:06

作者: liuqd 时间: 2009-8-29 20:54

谢谢！！

作者: msc-ihs 时间: 2009-8-30 14:49

xue xi

作者: sunyucheng 时间: 2009-8-30 20:32

支持下

作者: kleeo3 时间: 2009-8-30 22:51

谢谢

作者: liqiong29 时间: 2009-8-31 18:00

看来每个人对细胞覆盖率的理解还是不一样的。。。。

作者: 鹤之舞 时间: 2009-9-1 23:23

多谢

作者: zhangweihrb 时间: 2009-9-2 09:20

看图学习一下

作者: pushenglei 时间: 2009-9-2 21:13

aaaaa

作者: jiu2007tian 时间: 2009-9-6 16:32

1# 泡沫清风 4 Z2 K0 R( P1 e1 _: ]; x/ e L4 L: [
: X8 H" p7 ?( A; v$ A
学习学习

作者: water12006 时间: 2009-9-9 17:23

一路支持！！

作者: joicie 时间: 2009-9-10 19:44

：）

作者: fengxuyang521 时间: 2009-9-16 08:57

作者: yzzjx 时间: 2009-9-17 17:04

作者: tainlangxing 时间: 2009-9-23 19:09

看看，支持哈

作者: tyxy21 时间: 2009-9-27 22:00

看看细胞

作者: ruanyao57 时间: 2009-9-28 14:24

看看

作者: wyannb 时间: 2009-10-4 20:26

好啊，学习

作者: didi817 时间: 2009-10-7 17:16

1# 泡沫清风

作者: markllq 时间: 2009-10-9 13:34

xiexie

作者: 微微一笑 时间: 2009-10-13 15:43

学习！！！！！！！！！！！！！

作者: 张也行 时间: 2009-10-13 16:30

好谢谢

作者: 功夫猫 时间: 2009-10-15 10:41

继续学习

作者: duoduo777001 时间: 2009-10-15 12:30

学习

作者: a1jasmine 时间: 2009-10-19 11:46

学习一下

作者: piaobott 时间: 2009-10-21 18:08

我也在学这个楼主辛苦了

作者: yezi_830823 时间: 2009-10-23 15:03

吹打的时间好长啊！！这么长时间的吹打对细胞没有损害吗？

作者: mmssyyee 时间: 2009-11-1 21:59

常温放置1-2min,37度放置不行吗？

作者: 飞俞 时间: 2009-11-2 14:10

study hard

作者: 泡沫清风 时间: 2009-11-3 12:24

回复 55# yezi_830823
每个人的方法不同，用的仪器也不同，力度也不同，对吧，自己认为好就可以了，没有绝对的。

作者: 泡沫清风 时间: 2009-11-3 12:24

回复 56# mmssyyee
常温1-2min就可以，那在37度时间就更少了。也可以

作者: shaka74 时间: 2009-11-9 20:11

学习！！

作者: 大猪小猪落玉盘 时间: 2009-11-11 15:07

11

作者: camel_stone 时间: 2009-11-11 21:02

很详细的PROTOCOL.

作者: papilio 时间: 2009-11-17 17:20

学习！

作者: jmm008 时间: 2009-11-18 15:36

作者: tanhehe1006 时间: 2009-11-18 23:06

支持

作者: c3024034 时间: 2009-11-23 15:06

学习

作者: zengfang1102 时间: 2009-11-24 15:19

谢谢

作者: ziyunfei1982 时间: 2009-11-25 22:47

谢谢

作者: jessica.jr 时间: 2009-11-26 17:14

关注ing

作者: zhangmingqi111 时间: 2009-11-27 20:59

期待宝宝

作者: hww22 时间: 2009-11-28 19:33

ding ding idng di ngidng ding

作者: 江城公子 时间: 2009-11-30 14:52

关注

作者: lpzhdm 时间: 2009-12-1 13:04

继续学习

作者: jaycrazy 时间: 2009-12-4 09:01

回复 1# 泡沫清风
6 V1 ~6 a" w8 w1 @2 k
B7 G- ]* I& |% x% g) r" B; k0 ?
学习

作者: 上海过客 时间: 2009-12-4 11:06

支持下！！！！

作者: pjthust 时间: 2009-12-6 17:47

看下，学习

作者: wensui 时间: 2009-12-7 15:42

看看宝宝

作者: franklinhg 时间: 2009-12-11 02:05

作者: may21thwlp 时间: 2009-12-14 13:14

thanks

作者: chuanxuyang 时间: 2010-1-9 16:03

DDDDDDDDDDd

作者: xwp198527 时间: 2010-1-9 16:17

继续学习

作者: slong 时间: 2010-1-11 09:30

谢谢

作者: slong 时间: 2010-1-11 09:34

回复 7# 难得胡涂-1

细胞会掉

作者: 仰望星空 时间: 2010-1-13 01:43

作者: jayhaoli01 时间: 2010-1-14 10:36

hao

作者: bobo10679888 时间: 2010-1-17 00:41

xiexie

作者: zmxb 时间: 2010-1-18 19:43

谢谢楼主分享

作者: luoleihao 时间: 2010-1-19 00:26

继续看

作者: baisuilan 时间: 2010-1-19 17:44

学习学习~~ 谢谢分享

作者: sjtusjtu 时间: 2010-1-19 20:18

图片是用成像系统还是相机照的？

作者: wky98 时间: 2010-1-19 21:22

thanks for sharing

作者: 旺旺 时间: 2010-1-21 16:40

关注

作者: 幻石 时间: 2010-1-21 21:23

楼主辛苦了

作者: weichan08 时间: 2010-1-22 20:28

好！！学习学习

作者: chongke2010 时间: 2010-2-6 19:18

值得关注！

作者: tianqing0910 时间: 2010-2-19 13:42

谢谢，看看

作者: ethanliao 时间: 2010-2-26 09:34

xiexiexiexie

作者: ahfjwangrui 时间: 2010-2-27 22:25

qiangding

作者: happyant 时间: 2010-3-1 21:42

学习

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