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标题: 全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的骨髓间充质干细胞,问题可能出在哪呢？ [打印本页]

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作者: zlz2626    时间: 2009-8-24 18:49     标题: 全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的骨髓间充质干细胞,问题可能出在哪呢？

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1 m! M+ _( ^* m2 j2 M第五天的  全骨髓提取法

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作者: zlz2626    时间: 2009-8-24 19:07

上面是我用全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的 骨髓间充质干细胞   这是5天的  我是3天换液的  大家帮忙看看  感觉MSC  不是很多  其他细胞到不少     ！！
3 ~& `" q% n1 @( f/ E4 H 这个是我同时用PERCOLL  密度梯度法  一起做的   结果密度梯度法 提的细胞就是不贴壁  可用全骨髓提的道长了    因为我后期的实验对细胞的纯度要求很高   我怕全骨髓提的达不到我的要求        z: [5 }$ x+ \
密度梯度法细胞不贴壁的原因我分析了下可能有以下几点  , A7 H% f( {* X% u: X. f1 y
1.就是PERCOLL  的浓度  我用的是1.077的  体积分数60%   难道是浓度不可以
- Y2 O1 R8 v! y; M; u) b9 }2.就是离心这歩  我是2500转  25分钟   有没有可能对细胞造成损害不贴壁呢？4 c* I) N, d1 y. r* L
3.就是培养体系  我的培养基可能有问题  我用的是L-DMEM  加的10%的FBS 。不过全骨髓的 我也是用的相同的培养基  就长出来了  3 V' G) D; Y: ?. W' Z
   暂时就能想到这么多了   那位战友 能帮忙分析下  问题可能出在哪呢？

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作者: 饶冠华    时间: 2009-8-24 19:27


0 }6 k' n0 N; F- A1 C
: J( q9 ~+ Q5 ^6 s. k图片看上去怎么这么怪啊？ 为什么要用绿色背景啊？ 好难看~~  你为什么说觉得MSC很少呢？仅仅凭目测吗？还是你有染过MSC的marker??   你觉得那里面都有什么其他杂细胞呢？ 有没有依据？
# G, i( v% ~/ {( E4 m2 C# W! Z/ P6 [
  H% m: j5 \7 Z9 s; ?( k这张图片看不太清楚，建议你用倒置相差显微镜照明场 再发上来看看

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作者: zlz2626    时间: 2009-8-24 19:36

3# 饶冠华
& [* e! t& d( z  k- s4 A' k
- {; n7 j" G+ a9 ?% P+ ?- |! b* ]3 P( N4 }3 e/ I9 y
还没做检查 ，我让我们实验室的一个老师帮忙看了下  她说从形态上看 有BMSC  具体她也说不清    我也是头一次见到我养的东西  所以我也不知道  想请战友们帮忙看下了   其实用全骨髓法提也是战友们的建议  我就试了下  我原本是想用密度梯度法提的 可密度梯度法 没有出结果  而全骨髓法到长出来了  就是上面这张图   ) T+ c- G5 ^$ w3 m, k* Z; s3 y
至于为什么用绿色   呵呵  因为我们的实验室的倒置显微镜就只有绿光的  所以就用了

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作者: 饶冠华    时间: 2009-8-25 09:48

4 Y: u: U+ f9 U6 ^  \% e' H
6 k: D( \, ]: a6 j
4# zlz2626 * p  v  T" L! Z0 @9 w6 V
不可能吧，所有显微镜都有明场啊  你把滤光片调到没有颜色的那个档位  你去问问你们师兄师姐吧
. D  I# s  N3 u* l+ o另外，你把细胞传1~2代  杂细胞就应该会消失的.  另外建议你搜索几张MSC的图片看看，就心里有底了+ }% n1 C+ u7 ?8 C2 \7 e+ Z
[attach]2034[/attach]

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作者: li-baby    时间: 2009-8-25 14:55

密度梯度法细胞不贴壁，离心转速有点高吧，我们是1800转还算可以。

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作者: zlz2626    时间: 2009-8-25 21:30

5# 饶冠华
% A) k5 k* \( K/ L; g: E* z  g" |  j7 s' T0 \, i
+ |( G. O0 y1 c" u8 N7 k3 q4 A
谢谢了  我试试

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作者: zlz2626    时间: 2009-8-25 21:32

6# li-baby 1 d0 z1 H6 R) S4 G  k2 a- W- X

7 ~" ]2 D0 [. y" _7 }4 F8 y9 s* {1 z& w- w8 z3 a2 `" e' x2 u
能把你的整个过程详细说下嘛  包括PERCOLL的配制 ， 十分感谢

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作者: 02402122    时间: 2009-8-27 08:57

我不建议使用PERCOLL; a  k( @5 L) B/ j5 O0 u
全骨髓贴壁就满好的6 {5 [! j, p1 q
当然这是我的意见8 }% Q6 S4 v6 S# [% u
传三至四代细胞就能纯化很多
) U  [8 K3 Q0 \( }) v. `1 _3 b不行做个鉴定吧

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作者: 凤仪飘雪    时间: 2010-4-1 15:23

上面是我用全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的 骨髓间充质干细胞   这是5天的  我是3天换液的  大家帮忙看看  感觉 ...
( m9 b) l; u; _& L# |zlz2626 发表于 2009-8-24 19:07

0 w) W" y2 e% ~" s& P* q4 v
/ X, F' H7 v5 J  m2 {
1 _7 l# Q4 W# }9 d7 X! e# R( W    percoll应该用1073的才对吧？还有转速的确太高了，我平常都用1200~1500就足以分层了，20min就可以。不过经过比较我还是觉得全骨髓法效果比较好，用分离液细胞生长非常慢而且状态也不好。

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作者: 色色兔    时间: 2010-4-1 16:32

来学习下。

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作者: why121    时间: 2010-8-19 12:11

很感谢很多高手的指教哦 不过有几个疑问还是没明白  鼠源和鼠龄，接种的密度 胰酶的浓度 消化的时间 相信大家都有不同的感受吧 能分享下嘛 好让我们能找下基本的原因 谢谢

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作者: why121    时间: 2010-8-19 12:11

很感谢很多高手的指教哦 不过有几个疑问还是没明白  鼠源和鼠龄，接种的密度 胰酶的浓度 消化的时间 相信大家都有不同的感受吧 能分享下嘛 好让我们能找下基本的原因 谢谢

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作者: yedanna    时间: 2010-8-19 14:49

我也是全骨髓贴壁培养，一般情况下第5天就会出现很多个CFU-F，不象楼主的细胞那么分散。percoll本身有毒性，不建议使用这个，全骨髓法到第3代左右就已经很纯了。

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作者: 小熊不杀生    时间: 2010-8-20 12:50

Percoll 1800r 离心20min可以，你的离心转数有点高，所以可能导致细胞不爱贴壁，而且Percoll是比全骨髓法生长缓慢的，但是目的细胞可能比全骨髓法多，建议你别着急，继续培养着，最好还是能做个鉴定看一下，如果你后期需要的数量多，更应该做个鉴定

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作者: wsrz    时间: 2010-8-20 15:09

很感谢很多高手的指教哦 不过有几个疑问还是没明白  鼠源和鼠龄，接种的密度 胰酶的浓度 消化的时间 相信大 ...* W0 f4 P. s1 A  V& d: z5 c1 Y% ~/ J
why121 发表于 2010-8-19 12:11

2 E: m2 P! E* a! z0 f5 S6 o; e" B4 J. c! {/ |6 r) k

  ?$ e& [- W/ P    我用过110g（约4周）、60g（约3周）的SD大鼠，觉得后者培养出来的状态要好一些。接种密度一般在1X10^7/cm2。我感觉干细胞消化时间很难掌握，不好消化，我一般是胰酶+EDTA消化3min，再吹打、离心、传代。

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作者: zhang_tao1985    时间: 2010-8-22 00:01

从你的图片看可以看到bmscs，而且量也不算少啊，况且你没有鉴定，不能确定细胞类型的，还有就是你第一次换液的时间是三天，是不是有点长了啊，我看到过国内的一篇文献，做过对比，4-24小时贴壁的细胞是最适合培养的，72小时其他杂质细胞也可以贴壁了啊，试试看提前换液，可能对于杂质细胞的清除比较有帮助，还有就是传代以后的细胞纯度会比较高的。8 ?0 n' w, }2 }  _& a2 n; C4 t
看看这篇文献，希望有帮助
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