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标题: 请教一下给为前辈一些关于羊膜干细胞培养的问题，望指教 [打印本页]

作者: 2357710447 时间: 2017-7-10 11:43 标题: 请教一下给为前辈一些关于羊膜干细胞培养的问题，望指教

羊膜干细胞用什么方法培养，培养贴壁法or消化法？个人认为消化法好一点，用那种类型的酶消化、浓度、时间、比例等，希望前辈们多多指教，急需！

作者: fenglinzhu 时间: 2017-7-10 14:36

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我做过羊膜间充质干细胞的培养，消化法比较容易操作

作者: wzs1985 时间: 2017-7-10 15:35

消化羊膜：2 F- M# U+ k! {" \
1） 37℃水浴预热胰蛋白酶/EDTA。
2）将羊膜置于200ml cold PBS洗涤2-3次。! V. m9 [+ a5 k
3）羊膜分为3块，转移到3个新的50ml离心管，用20ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37℃水浴温和震荡消化羊膜20分钟。倒掉消化液。
4）分为3组：40ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA37℃水浴温和100rpm震荡，第1组羊膜40min*2次；第2组羊膜20min*4次；第3组羊膜30min*3次。* L. M5 s: I; }7 P
5）向第一次消化液中加入2倍体积的DMEM/F12完全培养基，1000 rpm离心5分钟。10ml DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹散细胞团，100-μm细胞筛过滤。1000 rpm离心5分钟，DMEM/F12完全培养基重悬细胞。
6）同样处理第二、三次消化液。每组每次的消化液不合并。* [1 C9 ?" v; H+ E I3 B' p2 {7 D
8 ^6 M$ H) z5 }* l8 U" d5 J' |0 s
仅供参考。

作者: 2357710447 时间: 2017-7-11 09:22

回复 fenglinzhu 的帖子% c0 D/ {/ O7 a/ G, ?

能讲一下具体的消化方法吗？感谢了

作者: 2357710447 时间: 2017-7-11 09:24

回复 wzs1985 的帖子7 h' b i4 l5 g/ u' f

感谢了但是我觉得用姨酶来消化次数和时间太长了现在大部分好像都是用一型胶原酶

作者: fenglinzhu 时间: 2017-7-11 10:04

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把羊膜剪成0.2~0.5平方mm的小块置玻璃皿，加10ml0.05%胰酶，搅拌均匀后置37℃消化15分钟后取出搅拌均匀，再消化15分钟。: m0 m0 p( o* _5 Y( ^
200目筛网过滤，并用PBS充分冲洗羊膜组织块。
收集悬液，离心所得的细胞即为包含羊膜间充质干细胞的细胞群体，可直接冻存，也可直接用于培养

作者: fenglinzhu 时间: 2017-7-11 10:05

回复 fenglinzhu 的帖子0 Q9 {1 L; \% U
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哦，对了，200目筛网过滤之前先用血清终止消化

作者: 2357710447 时间: 2017-7-11 11:04

回复 fenglinzhu 的帖子9 b( a4 i$ [3 w" V1 d: F# y; x
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这样消化下来不会有一些上皮细胞之类的杂细胞吗？消化的时候用50ml的离心管可以不，因为这样方便终止消化，离心管也好操作一些；终止消化可以用生理盐水将它稀释不？因为没有血清，过滤的时候可以用100目的滤网过滤吗，感觉那个过滤效果会好一些

作者: 2357710447 时间: 2017-7-11 11:08

回复 fenglinzhu 的帖子
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大概姨酶和羊膜组织块的比例是多少比多少来消化，消化效果好些，

作者: fenglinzhu 时间: 2017-7-11 11:43

回复 2357710447 的帖子- V" {- }; h0 c1 y7 g3 f1 _

会有一定的杂细胞，不管你用什么方法培养都会有一定的杂细胞啊，但杂细胞和间充干贴壁程度不同，贴壁时间不同，在培养基中生长情况不同，培养几代后就比较纯了。每次传代消化的时候那种难消化下来的细胞就放弃，这样可以提高纯度。胰酶能够淹没组织块即可，没有特定要求多少比例消化。100目也可以用啊，就是过滤起来比较慢。终止消化可以用含血清的完全培养基啊，稍微多加点就好了。用50ml离心管不是不可以，只是用50ml离心管可能比较浪费胰酶，不容易完全浸泡到嘛。

作者: 2357710447 时间: 2017-7-11 11:46

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好的感谢了我先实验一次有问题再请教你谢谢了

作者: fenglinzhu 时间: 2017-7-11 11:53

回复 2357710447 的帖子- {, V, P( v/ i+ |9 {" D# N; B- O
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我积分不够，加不了好友，你留个QQ号吧，我加你下" s3 u2 |- ~' d& s g- C

作者: 2357710447 时间: 2017-7-11 16:21

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2357710447

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