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标题: 关于 oct4 ssea4 tra-81-1的免疫荧光染色问题 [打印本页]

作者: maxiaorongqp    时间: 2009-9-7 16:47     标题: 关于 oct4 ssea4 tra-81-1的免疫荧光染色问题

各位大虾  ,OCT4 免疫荧光染色前 用TRITON 处理多长时间比较合适? SSEA4 和TRA-81-1 是否需要用TRITON 处理 ?
作者: 饶冠华    时间: 2009-9-8 15:11

我没有做过oct4的染色,但问过师姐 说 先用0.2%triton 打孔10分钟 冰上,然后再用1M HCl RT 10min----2M HCl 37°C 20min  ----PBS 3*10min
作者: xyzengh    时间: 2009-9-8 22:28

本帖最后由 xyzengh 于 2009-9-8 22:39 编辑 7 ?+ ]  U2 L$ Q6 N+ V/ {

6 F5 e' m$ C) X0 ^! a5 W8 rOct4是核抗原,所以triton是必须的,SSEA3/4是膜表面抗原,可加可不加,你为了方便可以都加,把我文章里面的方法发上来给你参考吧。/ r$ }" C* ?+ Y$ h  e  J
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Immunofluorescence Analysis) g; M# `& P$ i
Cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min., incubated in PBS containing 5% rabbit serum and 0.4% Triton X-100 for blocking and permeablization, respectively. PBS containing 0.5% Tween 20 (PBS-T) was used to dilute antibodies and wash the cells in the following procedures. The cells were incubated with antibodies against OCT4, SSEA-4,TRA-1-60 and TRA-1-81 at 37 °C for 1 h, followed by washing with PBS-T for three times. Afterwards, the cells were incubated with fluorochrome-conjugated, corresponding secondary antibodies at 37 °C for 45 min. and washed with PBS-T for three times. Finally, the cells were examined under fluorescence microscope to capture both phase and fluorescent images.
作者: xyzengh    时间: 2009-9-8 22:38

本帖最后由 xyzengh 于 2009-9-8 22:44 编辑 * C: a  {3 R% {+ Z4 {! u' W
: \7 ~- ?* y* z+ W9 k" N
再附上几张图让你有个感性认识吧。
作者: maxiaorongqp    时间: 2009-9-9 00:37

谢谢  请问你用0.4%的triton-100破膜 多久
作者: xyzengh    时间: 2009-9-9 09:30

10分钟就足够了
作者: cortex    时间: 2009-9-14 16:42

这个与你要染的部位有关,细胞膜上可以不透膜,胞质和胞核里的时间是不一致的。一般15-30min。
作者: hcluo    时间: 2009-9-17 23:48

是用激光共聚焦做的吗?
作者: xyzengh    时间: 2009-9-20 11:39

不是,普通的荧光显微镜就行了。
作者: sniper    时间: 2010-4-23 17:51

20_30min 就行,你也可以做几个不同时间处理的组对比一下
作者: beidouhan    时间: 2010-6-13 21:39

20-30minute,每次5-10minute,共3-4次
作者: 开心果王    时间: 2010-6-15 22:12

mES的免疫荧光做过几次了,但是每次效果都不好。荧光特别弱,跟老板以前做的荧光强度都没法比,被老板批了几次了。我染得是Oct4、SSEA1。通透10min,封闭液是5%二抗种属相同的血清+PBS,一抗稀释浓度1:100,二抗稀释浓度1:2000。染出来结果整个背景都很暗,不知道是啥原因,不知道哪位大侠可以指点迷津!多谢了!
作者: 上海过客    时间: 2010-6-18 10:22

不好意思 请教 一下 ,打孔 是 什么 意思 啊  ?
作者: nhzxcsc    时间: 2010-6-28 14:28

回复 13# 上海过客 ' I/ ^, u2 F1 Y$ }
& t- K' m5 k0 J+ T6 B* X- V

5 V# f2 H* n! O( k    打孔就是破膜
作者: 花开次第    时间: 2011-7-23 11:11

为什么做SSEA-1鉴定的这么少呢?它是一种膜抗原,如果加0.2%TRITON破膜,需要多长时间呢?
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作者: scottist    时间: 2011-7-25 13:22

借问一下,这几个marker染色对照是如何设置的?是否需要设置阳性,阴性对照,及只加二抗的对照?请高人指教,谢谢!
作者: 南风II级    时间: 2012-3-15 09:42

回复 饶冠华 的帖子
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请问做OCT-4在细胞中的免疫染色,为什么要用HCl呀?
作者: laputave    时间: 2012-5-16 14:56

SSEA-4的二抗一般用什么啊?$ k+ n' c+ B1 Z! A' a& s





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