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标题: 求助-怎么养MEF细胞 [打印本页]

作者: Te.L 时间: 2009-9-17 14:13 标题: 求助-怎么养MEF细胞

本帖最后由 Te.L 于 2009-9-17 14:15 编辑

我最近在养MEF细胞，但老是养不好，传了3代左右不仅长得慢，而且形态也不好。" R/ C$ M; R$ J7 u$ V
我用的皿和瓶是greiner的；DMEM高糖培养基+10%进口FBS+双抗。8 O( E/ _' M- `
传代是用0.05% Trypsin-EDTA，大概消化3-4min。
现在很是郁闷！急需各位的指点。MEF细胞难养吗？8 V4 N- V% d: ^0 X! t
谢谢！

作者: yunxinxu 时间: 2009-9-17 15:14

很难说问题在哪里？

作者: 双刀 时间: 2009-9-17 21:48

再具体点

作者: Te.L 时间: 2009-9-18 09:28

谢谢各位！我的是从协和细胞库购买的第一代，买回来细胞形态都很好。
但我传了一两次后细胞就出现了各种形态，像是张牙舞爪的。消化后正常的应该是均匀的、很圆滑，但我的变成了大小不均、不圆滑了。2 Z. G" e5 Y; E6 ~+ f
我想请教，你们对培养基和血清有什么要求？还要添加非必须氨基酸和谷氨酰胺吗？
能告诉我一些你们养MEF的具体细节吗？感谢

作者: Jonathan 时间: 2009-9-18 09:59

MEF培养基的话，我们实验室是要加L-Glu和NEAA的。而且我们不加双抗。

作者: Te.L 时间: 2009-9-18 14:17

谢谢楼上！那你们用什么牌子的培养基和血清呢？货号能告诉我吗？

作者: have-a-rest 时间: 2009-9-18 16:00

细胞培养和其他实验一样，都需要一个基本功，那就需要多样一段时间，自己摸索经验。MEF细胞培养也许是最简单的，但也不是一开始就能养好，多花点时间，会养好的。

作者: 芷瞻 时间: 2009-9-18 16:14

MEF完全培养基：3 c1 t! }5 v5 c" U2 M7 X
DMEM（Hyclone）+10%FBS（GIBCO, heat inactivated）+NEAA（1×,GIBCO）+ P/S（100units/ml P,100mg/ml S,Hyclone）
: k* ~: B# P0 r( o8 S& j3 h
双抗可加可不加，不过，加一点更放心，养细胞最怕污染，尤其是新手% J2 P0 q- X. U; ]
/ _) Y* f: D p; J6 z/ D8 V5 p
至于你谈及的细胞形态，MEF是典型的成纤维细胞状，你可以上传你的细胞形态图，大家给你分析分析6 r6 O9 [/ i& a5 B! n

祝顺利！

作者: 芷瞻 时间: 2009-9-18 16:22

至于Jonathan谈及的 L-Glutamine ，可以适当加点，本来DMEM培养基里含有，但是，时间长了，容易降解，所以，最好加点

作者: Te.L 时间: 2009-9-18 19:09

好的！谢谢大家！
我也会自己认真摸索，也非常期待能听到大家更多的意见！

作者: david123 时间: 2009-9-19 03:42

我认为你购买的细胞不纯，在分离MEF时，其他细胞没有去除干净，所以你培养时就会出现其他的形态。

作者: Te.L 时间: 2009-9-19 09:57

大家有用gibco的DMEM高糖培养基养的吗？

作者: Jonathan 时间: 2009-9-19 09:57

6# Te.L * d3 \* x# a4 y& D8 j# y* q
) Y4 \5 |5 R+ R! t) x) Y
培养基和血清都是用Hyclone的。FBS和DMEM高糖

作者: xyzengh 时间: 2009-9-20 10:14

MEF细胞恐怕算最好养的细胞了，NEAA要加，L-Glu和抗生素不是必需的，成纤维细胞本来就应该是“张牙舞爪”的嘛，呵呵，不放心的话发图上来大家帮你看看。另外MEF如果用于做feeder的话一般都不要超过3-5代，否则效果非常不好。你买回来第一代解冻后，第二代就大量扩增冻存，以后用一支解冻一支。

作者: 上海过客 时间: 2009-9-24 22:35

楼主我也遇到你一样的问题了， p0代，P1和p2代细胞都很好，但是到了p3代细胞感觉就不好了。我仔细的对照了一下自己的做法和别人的操作流程。% z* V- f' p+ `

可能的原因有两个  ：1 起始胚胎的种植量  没有按照 1个胚胎，一个T175的培养瓶的密度。我的是密度大大超过了，  10个胚胎只用了 5个10CM DISH 。细胞早就开始老化了。所以培养到P3代就老化了。
                  解决的办法是：  使用T175的培养瓶，密度严格控制。我已经订购了 t175的瓶子。
                  2 有可能是污染，开始不严重，随着培养过程进行，会显示出来。这个比价麻烦了。
               解决办法是：  重新培养。" b; |9 X$ l$ t8 |" a- K2 q
( Z/ G/ |5 a9 q* \
      针对这两个问题，可以先试试能不能解决你的问题。

作者: mmssyyee 时间: 2009-11-1 21:37

为什么要加NEAA啊，它起什么作用啊？只用DMEM+10%FBS+p/s不行吗？

作者: chendongbo338 时间: 2009-11-13 20:28

MEF细胞一般十倍镜下看是张牙舞爪的，主要细胞还是太密，该传代了

作者: crystalwangsd 时间: 2009-11-14 07:24

我养的MEF也只用DMEM+10%FBS+p/s. 看着也不错

作者: Jonathan 时间: 2009-11-17 13:39

回复 14# xyzengh

同意此说法，MEF一般到第六代，基本会死光光了。就算不死光，也会死很多，或者不会长。所以我们用来做ips的MEF，都是第二代的。第三代以上基本不用来做ips，而是用来做feeder。第四代做ips的话，效果很差，本人亲自实验过。

作者: Helena110 时间: 2009-12-14 22:39

MEF很好养的但一般都用传代3-5次的，多了都不常用，不知道你用来做什么的，最好应该也在传代五次前用吧

作者: Helena110 时间: 2009-12-14 23:16

回复 12# Te.L ' e4 R" m# T- g$ r0 n
/ G5 M! ? S4 |& J
我们就用的这种培养基百分之十培基效果很好

作者: Yedan 时间: 2009-12-16 23:17

MEF好养但是也不容易养好的，不注意照顾每传1次就老些，到第5代就不能看了。但是我们实验室的美国大牛人做iPS她的MEF用到P10的，让我们极其敬佩啊

作者: hansey 时间: 2010-3-5 20:53

回复 1# Te.L
; d9 W& H- D5 C* x
我觉得MEF最好在三代以内用，三代以后状态就不如以前了

作者: hansey 时间: 2010-3-5 20:55

双抗最好是不加，会或多或少的影响细胞的状态

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