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标题: 关于人IPS/胚胎干细胞培养的几个问题。 [打印本页]

作者: 上海过客 时间: 2009-10-9 10:44 标题: 关于人IPS/胚胎干细胞培养的几个问题。

本人刚开始学习培养人 IPS细胞，时间有一个月多，感触特别的多，每次到困难时刻都有打退堂鼓的时候，但是还是要坚持啊。作为一个博士研究生，这点问题都解决不了。做研究的意义就不大了。- K  s7 V& Y5 E; E, D" c) k7 t# @
能得到克隆，但是一传代就完了，什么也没有了，或者长得很慢。国庆这几天的细胞干脆就连滋养层细胞一起死了。也不知道什么原因。还剩下一管冻存的细胞，不敢动了。等把问题解决了在来解冻。所以有些问题需要大家的帮助，希望大家不吝赐教。' c) C: k! `; Y0 {# }! ^

结合自己的经验和教训来谈谈有关的问题。主要是向有经验的大侠来请教+ M# w8 M) K$ f4 b2 |/ ?3 i) ^3 x# u

想要说的话很多，慢慢来补充吧

1  关于试剂的问题。我会把详细的资料贴上来，大家看看有没有什么问题。
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培养基和血清替代品，NEAA，GLUTMAX 等见图片所示。但是有两个问题没有注意到：  a 2-巯基乙醇，但是考虑到实验室有就没有买。可是实验室里用的是化学试剂级的不是细胞培养级别的。这个问题是不是会影响到我的细胞培养很难讲。
      b bFGF 的问题，报价单上有两个，当时图便宜买了价格低的那个。但是国庆这几天反过来看资料的时候没有看到 PHG0024用于胚胎干细胞培养的说明，真是欲哭无泪。不知道是不是也会影响实验的进程。另外就是 bFGF 的配置，参照了wicell的方法，但是分装的的管子里每次解冻时都会看到白色的沉淀，很让人担心啊。
配置的时候是用的超纯水配的BSA 然后溶解 bFGF  .并没有用PBS来配置0.1%的BSA。知道大侠请给一个详细的说明吧，包括Bfgf的不同货号的区别和配置的方法。
2  MEF问题 a 品系： MEF我用的是昆明鼠的孕鼠，因为当时西安能提供孕鼠只有这一种。我也看到有人用昆明鼠来做滋养层，所以就采用了昆明鼠，不知道有没有什么方向性的错误。5 E! m7 Q2 r: x* R( r$ x# S
            b  培养密度：第一次做，密度太大了，接种第二天细胞就挤到一起了，伪足都没有了。这样的细胞老化的快，很有可能影响到胚胎干细胞的生长和增殖。  10.1 期间我又做了一次，但是密度还是有点大，主要是太贪心，所有的胚胎都想用，考虑到培养箱的空间有限，所以每个T175的培养瓶装了两个胚胎，密度还是比要求的大了两倍。
3 传代的问题，尽管可能由于以上的问题会造成细胞生长和增殖速度的问题，但是还是有克隆长出，于是又面临传代的问题。用的是机械传代的方法，用5寸的巴斯德管拉的挑针和吸针。  传代中的问题
   a:  总是在挑克隆的时候才把MEF的培养基换成干细胞的，这个不知道有没有影响
   b: 自我感觉培养板在超净台上暴露的时间过长，不知道会不会有影响
   c: 划得克隆总是会卷起来，并不是一个个的小块，不知道是什么问题。原打算用RT检测一下细胞团是不是分化了，但是细胞少就没有做。  猜想如果是分化的细胞可能会有这样的结果。' y' @$ C; q- j/ G( t
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      以上是我遇到的一些问题，以及需要注意的地方。还需要大家的帮助，完善我的实验流程。  陆续补充吧。

作者: 上海过客 时间: 2009-10-9 10:47

图片不太清楚，可以下载下来看。% j+ [; H. r# e& ^

要是 PGH 0024不能用于胚胎干细胞培养的话，用什么来代替。1 a1 m" H0 ^( N3 {( J
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现在知道有三家公司的产品了。

作者: 上海过客 时间: 2009-10-9 10:50

巯基乙醇已经购买了 GIBCO的了，不知大什么时间能到。
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现在只能是按兵不动。

作者: 上海过客 时间: 2009-10-9 10:50

巯基乙醇已经购买了 GIBCO的了，不知大什么时间能到。
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现在只能是按兵不动。

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