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标题: 大家来谈谈CIK细胞 [打印本页]

作者: gloria550 时间: 2009-10-15 16:46 标题: 大家来谈谈CIK细胞

同题

作者: sailboat 时间: 2009-10-20 17:50

什么是CIK？& Y: V' V5 r$ J; O% o6 F+ ^
CIK，即cytokine induced killer的简称，中文称之为“细胞因子诱导性杀伤细胞”。
CIK是一种高效杀伤活性的异质性细胞群，是一种新型高效的具有广谱杀肿瘤、病毒活力的MHC非限制性的免疫效应细胞，具有增发殖速度快、显著杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞，清除病毒的活性。CIK细胞疗法是过程性免疫疗法之一，是目前抗肿瘤，抗乙肝、丙肝治疗最新、最好的免疫治疗方法。; X1 o7 z* W& y

CIK细胞抗肿瘤、抗病毒的作用机制：
CIK细胞是外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导培养产生的一类细胞群，培养简易，扩增迅速，是具有高细胞毒性的杀伤细胞，其抗肿瘤、抗病毒活性显著。+ P Y N b4 c" o0 @; `
CIK细胞疗法是过继性免疫疗法之一，在多种细胞因子IL—2，IL—1、IFN—r，抗CD3单克隆抗体等诱导下将从外周血，骨髓或脐血中分离出的淋巴细胞群，经过一定时间的培养而获得的一种具有NK细胞作用的活性免疫细胞，能识别多种肿瘤细胞和病毒感染的细胞，通过与靶细胞直接接触、杀伤或分泌IFN—r、TNF—a，IL—6等多种抗肿瘤和抗病毒的细胞因子，抑制杀伤肿瘤细胞和病毒的复制，有效调节机体的免疫功能，提高患者机体抗肿瘤抗病毒能力。

作者: luoye1986 时间: 2010-11-27 08:14

制备CIK首先进行分离淋巴细胞，分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。
一些经验! h5 o5 P% J$ |& J1 A/ }
1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释
2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）
3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。& r! d! x0 x3 b7 G  z5 I: X! `
4. 离心 .转速：1500/分 + d+ \, H0 X  U3 t' o" Q2 U( g) U
温度20c －28c
时间：20分钟' i4 l; L9 w9 H9 E3 W; s5 r* ~
no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)9 e% y, [, D5 U) j$ i5 m, T( ?
5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞
6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！. `# g9 I' c3 |$ m, e$ ], j
7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。% r  V3 s) Y+ {$ k+ ?, A9 \6 b
8 离心。转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)
时间：10分钟  \8 U: a4 o: s. I, L6 {" Z) J
温度：4c
9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）/ o% Q  l/ \* E4 v5 W* P
10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？+ n& [3 X9 x( v6 B
11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.0 {; r' Y1 m1 @/ [$ u  u" b+ F
a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）& J$ W2 J8 r- U8 @
b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞
c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形& o! a/ G$ U5 h) N. i
d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度
e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？）
12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2
25－50u/孔后，放入培养箱.

作者: deron 时间: 2011-7-2 20:13

回复 luoye1986 的帖子: `/ L4 S& F+ {" ?) y G" w
L5 p/ ?) ?; Z/ M
落叶的资料很受用。
个人认为最大的亮点在于最后的2滴/孔的血浆加入。血浆，按照步骤来看，就是稀释了一倍体积的含纤维蛋白原的血清。通常24孔板的max体积是0.5ml，一滴液体的体积是0.05ml，如此一来计算可以得知，落叶相当于在加入10%的新生牛血清之后，又加入了10%的自体人血清（考虑到抗凝过程中加入的肝素，可能只有5%左右）。理论上，既提供给了细胞熟悉的生长环境因子，又丰富了培养基的营养成分，一举两得。* ?7 [- p( f; }, f' z$ W: ^
可是这也是我疑惑的地方，血清中含有抗凝剂，对培养有没有负面的影响？血清中含有的纤维蛋白原，会不会在抗凝剂失活后发生凝集反应呢？楼主有没有遇到培养中的这些情况

作者: zhenhuale 时间: 2011-7-4 09:28

同问

作者: luoye1986 时间: 2011-7-4 11:25

回复 deron 的帖子# w7 j# A: q; c/ f" r

这个问题没有重视过，谢谢你的提出。但我认为在反复的培养和离心过程中抗凝剂（肝素钠）会减少或分解消失，到目前也没有发现什么负面影响。

作者: lizzy_81 时间: 2011-7-4 11:48

这种细胞治疗肿瘤真的有用吗？我做了四年这个细胞，越做越没信心

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2011-7-4 15:50

没威望都下不了资料，希望给点威望，可以下东西

作者: haiq1984 时间: 2011-7-4 16:30

回复 lizzy_81 的帖子" t) k6 _5 U+ C) }
: a Z, X/ D7 M& p2 i
做了四年，怎么会越做越没信心呢？是不是在临床上的应用方法有欠缺的。
体外试验来看CIK的溶瘤效果还是不错的，有什么问题可以拿出来讨论下的。

作者: shayatoulhb 时间: 2011-7-5 10:57

我们科室准备引进此项目，很受益，谢谢！

作者: luoye1986 时间: 2011-7-5 13:53

回复 haiq1984 的帖子

我们是刚开始做，再说对于肿瘤疾病的疗效很不好定义标准，就像晚期的，能够延长生命几个月的就已经算很不错的了，对于早期的，根治几乎不可能，只可能减缓癌变的速度吧，这只是我个人看法，呵呵

作者: haiq1984 时间: 2011-7-5 14:49

回复 luoye1986 的帖子
3 y. W b1 S: F" S4 w- k0 m" d; K7 a
现在好像主要用于放化疗后的免疫康复，CIK对于放化疗后残存的肿瘤细胞，延缓肿瘤的复发。单一应用CIK治疗根治肿瘤，应该是不行的，它只能表现为对肿瘤细胞的免疫杀伤，但不能根除吧。: ^; n/ z6 H+ g8 j9 w+ W; i- _; J- ~
不过个人感觉这种治疗方法对于提高患者的生存质量还是很有帮助的。 l1 @! p! Z" x# U' T% Q) Y
个人意见。

作者: luoye1986 时间: 2011-7-5 16:19

回复 haiq1984 的帖子
" G7 Q6 n( _5 ?3 N
对，现在不是有CIK-DC共培养和联合治疗嘛，不知道效果怎么样

作者: haiq1984 时间: 2011-7-6 13:48

理论上来说DC-CIK联合应用更加诱人。

作者: joesiezhao 时间: 2011-8-15 14:08

最后一步加入人血浆，这个好像已经淘汰了吧，由于人血清应用于临床有很多严格的条件，现在都用无血清培养基。

作者: kosmos.y 时间: 2011-8-17 11:00

我们实验室也有培养T细胞的，一般按下面这个步骤做，
3.以一袋血为例，大概20-30ml，以1:1用生理盐水或者PBS稀释血液（要注意用酒精棉球擦拭血袋开口）2 |3 c" n0 {8 K4 E
4.将混合的液体沿离心管壁缓慢加入到装15ml的淋巴分离液的50ml离心管的液面上。比例是1：2(淋巴细胞分离液主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺，主要用于（1X107/ml浓度的细胞）
5.室温1600rpm 20min  升速为7，降速为2。离心后第一层为或者组织匀浆液层。第二层为环状乳白色淋巴细胞或单核细胞层。第三层为透明分离层。第四层为红细胞层。（红细胞层表明悬起的部分白细胞可以加入几ml，pbs反复离心洗将这部分白细胞也收集）  }  `8 l$ T& X) {3 e/ U
6.吸取上层白膜，尽量避免吸取红细胞。
7.上清液用生理盐水或者PBS补满，1800rpm  8min6 p2 c0 |* }* I- j
8.弃上清，沉淀即为PBMC
9.生理盐水或者PBS  1300rpm 10min 再洗一次3 \- w. G1 Z& v# @0 E; h% r6 B
10.用1640培养液  10%四季胎牛血清培养  贴壁过夜或者45min
11.贴壁是让DC等细胞贴壁培养，然后我们取悬浮液，悬浮液即为淋巴细胞。% ~: U: p  Z/ {: N
12.然后就加各种细胞因子，获得想要的各种T细胞。因为剩下的细胞主要以CD4+和CD8+为主

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