干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 关于人IPS/胚胎干细胞培养的几个问题。 [打印本页]

作者: 上海过客 时间: 2009-10-21 21:01 标题: 关于人IPS/胚胎干细胞培养的几个问题。

本人刚开始学习培养人 IPS细胞，时间有一个月多，感触特别的多，每次到困难时刻都有打退堂鼓的时候，但是还是要坚持啊。作为一个博士研究生，这点问题都解决不了。做研究的意义就不大了。
能得到克隆，但是一传代就完了，什么也没有了，或者长得很慢。国庆这几天的细胞干脆就连滋养层细胞一起死了。也不知道什么原因。还剩下一管冻存的细胞，不敢动了。等把问题解决了在来解冻。所以有些问题需要大家的帮助，希望大家不吝赐教。) r$ \  g. l  p" O3 g

结合自己的经验和教训来谈谈有关的问题。主要是向有经验的大侠来请教

想要说的话很多，慢慢来补充吧

1  关于试剂的问题。我会把详细的资料贴上来，大家看看有没有什么问题。
7 n0 @  J: W% q2 A  g9 R9 u
培养基和血清替代品，NEAA，GLUTMAX 等见图片所示。但是有两个问题没有注意到：  a 2-巯基乙醇，但是考虑到实验室有就没有买。可是实验室里用的是化学试剂级的不是细胞培养级别的。这个问题是不是会影响到我的细胞培养很难讲。6 [6 A- A# i% g* l8 s' `
      b bFGF 的问题，报价单上有两个，当时图便宜买了价格低的那个。但是国庆这几天反过来看资料的时候没有看到 PHG0024用于胚胎干细胞培养的说明，真是欲哭无泪。不知道是不是也会影响实验的进程。另外就是 bFGF 的配置，参照了wicell的方法，但是分装的的管子里每次解冻时都会看到白色的沉淀，很让人担心啊。
配置的时候是用的超纯水配的BSA 然后溶解 bFGF  .并没有用PBS来配置0.1%的BSA。知道大侠请给一个详细的说明吧，包括Bfgf的不同货号的区别和配置的方法。
2  MEF问题 a 品系： MEF我用的是昆明鼠的孕鼠，因为当时西安能提供孕鼠只有这一种。我也看到有人用昆明鼠来做滋养层，所以就采用了昆明鼠，不知道有没有什么方向性的错误。
            b  培养密度：第一次做，密度太大了，接种第二天细胞就挤到一起了，伪足都没有了。这样的细胞老化的快，很有可能影响到胚胎干细胞的生长和增殖。  10.1 期间我又做了一次，但是密度还是有点大，主要是太贪心，所有的胚胎都想用，考虑到培养箱的空间有限，所以每个T175的培养瓶装了两个胚胎，密度还是比要求的大了两倍。5 q  v  x* `9 Q' ^" H, W* ~
3 传代的问题，尽管可能由于以上的问题会造成细胞生长和增殖速度的问题，但是还是有克隆长出，于是又面临传代的问题。用的是机械传代的方法，用5寸的巴斯德管拉的挑针和吸针。  传代中的问题   W1 f0 x6 K8 S. }% s* v: W
   a:  总是在挑克隆的时候才把MEF的培养基换成干细胞的，这个不知道有没有影响
   b: 自我感觉培养板在超净台上暴露的时间过长，不知道会不会有影响
   c: 划得克隆总是会卷起来，并不是一个个的小块，不知道是什么问题。原打算用RT检测一下细胞团是不是分化了，但是细胞少就没有做。  猜想如果是分化的细胞可能会有这样的结果。3 N9 F3 c: t! q/ L: a
: k( T$ k- y1 S! ]; j" l/ I9 _" R) |
      以上是我遇到的一些问题，以及需要注意的地方。还需要大家的帮助，完善我的实验流程。  陆续补充吧。

作者: 上海过客 时间: 2009-10-22 17:31

没有人回复啊 :'(# s% i2 P, m+ T& G; g4 H' y% c& d
5 t g. ]2 U$ z
已经对培养基和MEF进行了改进。

作者: gemstone 时间: 2009-10-30 12:05

关于试剂的问题，你可以用人的ES细胞培养一下看看，如果ES细胞都培养不下去，iPS怎么能成功呢？关于饲养层的问题，我觉得饲养层细胞密度过大或者太稀都会引起ES或者iPS的分化。最好的办法是处理一批MEF然后冻起来，用一管测试一下浓度，计算好每管能cover的面积。以后就比较一直了。
挑克隆的时候，最好不要时间太长，培养液可以在挑克隆前几小时换好，单个克隆在96孔板扩增。原代克隆其实不用急着机械打成小块，整个克隆转移到一个96孔中让过渡一下，下次传代就可以用IV胶原酶了。

作者: bukittimah 时间: 2009-11-7 14:16

问题也可能出在病毒包装上。滴度不够。你的克隆可能是pre-iPS 而非真正的iPS。
-你在广州结识的同道

作者: fguw 时间: 2010-5-12 01:30

配置的时候是用的超纯水配的BSA 然后溶解 bFGF .并没有用PBS来配置0.1%的BSA。知道大侠请给一个详细的说明吧，包括Bfgf的不同货号的区别和配置的方法。-----应该没有问题

作者: hansey 时间: 2010-5-12 11:27

不知道你的克隆是不是假阳性，如果是的话可能挑出来后就不长了

作者: maozhuxiwo1 时间: 2010-7-19 18:59

我们实验室的IPS组用的都是SIGMA公司的什么都是最好的。如果你只有普通的药剂，可能很有影响吧

作者: maozhuxiwo1 时间: 2010-7-19 19:02

挑克隆的时候，我也出现过卷边，你可以尝试一下，先画个井字，然后从边上一点点往外扣。

作者: 573639471 时间: 2011-4-26 21:53

回复上海过客的帖子
2 F$ p! l0 u- N) e- t# U' w
你好，你是西安的吗？我是西工大的，最近在北京养ips，刚开始，你的ips现在状态都很好吧

作者: mike19840320 时间: 2011-5-12 20:36

你好，我刚要养IPS,请问养IPS直接用干细胞培养基就行吗，还需要用MEF吗，具体过程是怎样的？谢谢！！

作者: christophe 时间: 2011-5-12 21:49

回复 mike19840320 的帖子! k- ?* r0 _/ W" i. f! [

养IPS必须要在feeder细胞上用干细胞培养基，用MEF培养基肯定不行的。干细胞培养基可以用有血清的培养基或者无血清的KSR培养基，具体的配方和步骤很多已经发表的文献当中都有的。

作者: zhusealin 时间: 2011-10-13 16:30

需要用MEF,不用MEF那就是无滋养层培养了

作者: yangpan521 时间: 2011-10-13 16:49

培养用的试剂最好用细胞培养级，化学级肯定有影响，

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)