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标题: 如何用PCR扩增长的片段 [打印本页]

作者: plando 时间: 2010-1-11 21:12 标题: 如何用PCR扩增长的片段

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

作者: ziyunfei1982 时间: 2010-1-17 18:49

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR
会很辛苦，看运气了。

作者: hawkyiger 时间: 2010-1-25 16:37

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

作者: franklinhg 时间: 2010-1-25 16:49

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈: }6 K) x$ X1 D* { x
但是实验的时间和工作量都比较大

作者: shihuijunm 时间: 2010-8-21 08:47

本帖最后由细胞海洋于 2010-8-21 21:03 编辑
b- ]1 B9 M, v
选好的PCR酶，保真性高的,

作者: shihuijunm 时间: 2010-8-21 21:09

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

作者: weiyepan 时间: 2010-8-22 20:59

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；
如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。
最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！2 e4 `; K9 n7 S! ^0 d( X$ q
本人PCR牛人，大家交流哈。

作者: weiyepan 时间: 2010-8-22 21:12

回复 3# hawkyiger
另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：% l* v: V2 H* B- ^
首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；+ M- e9 N/ d: |* B8 o
第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

作者: yueyongheng 时间: 2010-8-23 00:00

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。. u9 T2 ]* l0 n) a
普通 PCR反应：
Taq DNA Polymerase ( C! ^ u8 P( w/ y4 v9 K
rTth DNA Polymerase
高效率 PCR反应：
Blend Taq
Blend Taq Taq-Plus Plus- 2 X% ^0 U: g5 Y6 H9 B$ ]- L
KOD Dash (LDP LDP-101)
KOD KOD-Plus Plus- & r* u. D9 r0 N; t
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2
KOD FX
高保真 PCR反应：
KOD DNA Polymerase
KOD KOD-Plus Plus-
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2
KOD FX
长片段 PCR反应：. R2 w" l$ t! Q3 X) W Q8 i4 b n
Blend Taq Taq+ H& J' f3 V2 X; i% N
Blend Taq Taq-Plus Plus-2 |3 \2 E0 b0 }6 m( S/ A. N
KOD Dash
KOD FX

作者: exin11 时间: 2010-8-23 08:17

学习了

作者: chenhuachen 时间: 2014-2-27 22:10

回复 weiyepan 的帖子" ?# Y6 w: J! _; n5 [

你好，想问一下第三条中“逆转录文库”指的是不是cDNA？

作者: julia20 时间: 2014-3-1 01:14

回复 weiyepan 的帖子5 c* B, U3 C B+ J
1 [+ C8 r5 {) c& y% ?6 G
长片断是在基因组或者是逆转录文库里面是什么意思? 这些不好做, 那在其他什么情况好做呢? 谢谢!

作者: weiyepan 时间: 2014-3-4 08:59

回复 chenhuachen 的帖子

是的

作者: weiyepan 时间: 2014-3-4 09:03

回复 julia20 的帖子
( ] x# j7 l2 c, B& |# n
cDNA一般很少能转到5k以上的，一则反转的体系不行，二则常温合成RNA的二级结构影响很大。基因组用Taq好扩，这是公认的，而长片段Taq又容易引入突变，所以在基因组里面拿长片段不太实际，只能分段扩。

作者: 石山巨石 时间: 2014-3-4 10:34

7KB 不是非常长可以直接做的不用桥接

作者: zhucexiaji 时间: 2014-3-11 09:30

7kb不算太长，你可以在NEB, TAKARA等公司选择他们的长片段PCR酶来扩增，引物设计按他们的推荐要求来就可以了，简单的很，不过模板质量要求要高，呵呵

作者: yiyi8909 时间: 2014-3-13 19:37

公司有卖专门扩长片段的酶和buffer，注意dNTP的量要相对增加

作者: 碧螺春的秋天 时间: 2014-3-14 11:23

用KOD高保真酶，不用桥连，直接P就可以。如果条带不特异或者不亮，可以梯度PCR摸一下最适退火温度，循环数不用太多，延伸时间要足够

作者: chenhuachen 时间: 2014-3-21 19:48

回复 weiyepan 的帖子

你好，想请教一下：我最近在扩TP53的全长，用tiangen的hotstart taq酶扩增后条带很弱，怎么办？是taq酶的问题吗？另外最底下的引物二聚体比较亮

作者: weiyepan 时间: 2014-3-22 12:21

加点betaine，初始模板多加点，循环数+5

作者: 细胞海洋 时间: 2014-3-23 11:15

回复 chenhuachen 的帖子) J8 J) T" P$ z5 g/ _

看20楼

作者: zm19900508 时间: 2014-3-25 08:37

回复 weiyepan 的帖子3 q8 K9 V( ^2 X' C7 L: ~4 F& R; p
2 Z& {$ _8 @4 K2 l: o
高手！以后分子克隆问题要向你讨教。

作者: plasmid 时间: 2014-3-25 16:20

据说KOD高保真酶可以的

作者: chenhuachen 时间: 2014-3-30 20:45

谢谢，请问甜菜碱要加多少?另外，不知道为什么加了dmso之后10%连条带都没有了，郁闷

作者: chenhuachen 时间: 2014-3-30 20:53

能帮我看看这条引物吗？二聚体挺亮的，在ncbi找的算是比较好的，分析过。! I$ b+ C' T, \
TCCCCTGAAGACTGGATAACTG FWD。RSD TAGGTGCCAGGTCCAACAAC。一直摸不好条件，郁闷死了

作者: chenhuachen 时间: 2014-3-30 20:54

大鼠的

作者: 细胞海洋 时间: 2014-3-31 09:56

回复 chenhuachen 的帖子+ V6 V# V9 d: l3 B# ~& a9 u/ w

你回复谁就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容像我这样

否则他会看不到

作者: 石山巨石 时间: 2014-4-13 00:17

本帖最后由石山巨石于 2014-4-13 00:18 编辑 5 {+ w3 S. e6 q: w6 k
4 t$ W, k6 z+ k6 B5 K
Betain 和 DMSO我记得是为了帮助GC rich DNA的解旋和长度没有什么关系

作者: chenhuachen 时间: 2014-5-14 22:26

回复 weiyepan 的帖子& w8 {) h' ?5 ^- v% v$ D

你好，请问提完DNA后可以酶切后直接PCR吗？实验需要在PCR前酶切，做点突变验证，酶切位点是正常对照。

作者: yinyu0511160 时间: 2014-5-23 00:21

fast pfu 好像能搞定

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