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标题: 大家有做细胞爬片的吗 [打印本页]

作者: 火云豹 时间: 2010-1-12 17:30 标题: 大家有做细胞爬片的吗

我做细胞爬片想用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液增加细胞的粘附能力但不知道哪个的效果更好有人有做过的吗

多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液) ~( {) r5 R/ A! J, v: Z- a
也有人说
爬片之前用0.1％明胶涂玻片
4 G3 P7 k- s6 e
大家讨论一下

作者: suhsia 时间: 2010-1-15 22:40

看看嘛

作者: foxp3 时间: 2010-1-20 16:24

关键是你是什么细胞！不同的细胞对于你说的那几种粘附介质效果不一！所以如果你有条件，可以几种都试试，如果没条件，选择多聚赖氨酸就不错，这个用的比较多！

作者: 火云豹 时间: 2010-1-20 19:04

好大家可以学习了

作者: ziyunfei1982 时间: 2010-1-21 10:17

关键在爬，1.细胞种类很重要，不贴壁的细胞就很难了，
2.细胞得沉降到附着物体表面
3.附着物体表面可以让细胞有极性，分泌一些细胞外基质或者膜表面锚定蛋白

作者: kuangxiaocong 时间: 2010-1-30 09:03

不如拿细胞团块来切片

作者: oliviawy 时间: 2010-2-27 22:44

我是用得硅化的玻片，不需要自己再处理，效果挺好的。: k! F+ ]( M' s: z% z0 @5 w4 r
另外，你还可以做细胞蜡块，蛋白定位更准确一些。

作者: prettybear 时间: 2010-3-9 13:58

本帖最后由 prettybear 于 2010-3-9 14:00 编辑

如果是贴壁生长的肿瘤细胞直接爬片即可。 r% ]! L- Z9 G1 e, c; K
3 R+ u. a i4 P0 |
将盖玻片用蒸馏水轻轻洗去浮灰（进口的不用，国产的较脏），放入80-100%的酒精中，用镊子取一块在酒精灯上燃烧（易碎，做熟了就好了）后，放入6孔板中。冷却后将细胞种上即可（一般需要长过夜以上）。长好后用多聚甲醛固定后做免疫组化。4 s6 V+ \0 U# |/ z

不太脱片。

作者: 小鲁鲁 时间: 2010-3-16 15:09

多聚赖氨酸，这个在爬片中比较常用，可以根据需要调节浓度；
层粘蛋白，这个没用过；
胶原的种类很多，常用的有鼠尾胶原和人胎盘胶原，而且在transwell中用的比较多。& d: `( ^ s/ y8 s4 G
个人的感觉是这类增加贴壁的试剂的使用与否要和细胞的种类相关，比如上皮细胞，一般贴壁就比较紧，不太需要。国产的盖玻片的话，质量很不好，现在有处理好的现成品出售。经济上允许的话，建议买成品的使用。

作者: yac508 时间: 2010-4-7 21:04

根据你的细胞来选择的，你用的细胞种类不同就不行; r$ s/ |! G2 V9 l0 u |: ?
我以前用过一些细胞（非干细胞）不用处理玻片就可以粘附上，: Q% ~; k+ C9 ?
如果你觉得需要处理的话，我建议还是多聚赖氨酸，3 Y+ ~' d1 ?/ d1 e2 c; S6 _% L
这样处理的方式是abcam抗体公司提供的实验方案提到的。

作者: xxzhang83 时间: 2010-4-26 21:32

我用1%明胶，用来贴内皮细胞。
每种细胞用的包被都不尽相同，你要查一下你爬的细胞用什么包被最好。

作者: iash 时间: 2010-4-29 18:35

很多人都是用多聚赖氨酸，我是贴壁细胞，直接将盖玻片放到六孔板，细胞悬液加到盖玻片上，加培养液过夜，第二天就可以了，也不太脱片

作者: wang_kai1212123 时间: 2010-4-29 22:23

根据你的细胞种类就可以了，如果是贴壁细胞不必处理，直接放在载玻片上然后将载玻片放到6孔板里培养，前提是现在载玻片上滴上几滴，待4个小时后贴壁细胞贴上去之后，在加入适量的培养液。培养几天后当载玻片上细胞覆盖率达到70%左右即可做荧光染色了。如果是悬浮细胞，首先要离心，然后加培养液，细胞适量后，可以直接放到载玻片上，做免疫荧光。个人拙见，请大家指教~~~~~

作者: 火云豹 时间: 2010-5-2 21:28

好可以学习了

作者: mq402716390 时间: 2010-5-20 16:50

1.细胞种类很重要，不贴壁的细胞就很难了，! d+ q- }0 k, z  V1 N" {& j9 q7 X
3 T: I2 f% j! {; ^, D& x       2.细胞得沉降到附着物体表面* R, [7 F8 G: y, V0 Y5 j- i% d. ~, t. J1 O! F+ N, h3 V; |
      3.附着物体表面可以让细胞有极性，分泌一些细胞外基质或者膜表面锚定蛋白

作者: luckykiki 时间: 2010-5-25 12:42

受益

作者: xbs530515 时间: 2010-5-27 22:54

贴壁细胞一般还是没有问题的，你具体是做的什么细胞，我做过小鼠巨噬细胞，直接在12孔板里放灭菌后的小玻片，细胞贴附的很好，之后就进行免疫组化和其他的染色，挺方便的。如果你的细胞的确不好贴，可以试试多聚赖氨酸处理爬片，这个用的也多。

作者: wenwen629 时间: 2010-6-10 09:49

赞成8楼的说法

作者: wryyx 时间: 2010-7-23 20:48

多聚赖氨酸好，我做过

作者: sunnyhuimin 时间: 2010-9-1 20:42

本帖最后由 sunnyhuimin 于 2010-9-1 20:43 编辑

你的细胞是什么，如果是间充质干细胞，我前段时间做间充质干细胞免疫组化就是细胞爬片，一些经验可以交流下：' E# l7 _+ u# x6 D; Z
1针对免疫组化，我查的资料说如果用多聚赖氨酸包被会影响组化结果，会出现假阳性结果，所以我认为没有必要用，只要保证玻片干净无菌细胞爬片是没问题。7 A- D6 u" ~4 `
2 如果想细胞爬片好，要保证你的细胞状态是很好的，也就是贴壁性及生长状态好。$ l5 ^4 ?3 H* q1 K
3玻片清洗、浸酸过夜、再次清洗、高压灭菌都要保证质量，而且在种细胞时玻片最好能和使用的小皿孔径一致，玻片贴于皿底且加medium后不漂起。# X! u% Y% b4 @* |0 E) I
4在免疫组化的过程中清洗时力度不要太大，PBS没过玻片后，轻轻晃下就可以了，时间到后，用枪头靠近皿壁吸掉PBS洗液就可以了，这样就可以防止脱片。
5细胞爬片时间建议为48h,可以保证爬片数量和质量。
希望对你有帮助

作者: wangqingyao2004 时间: 2010-9-17 08:48

我同意楼上的，我以前做过基质细胞，也不需要多聚赖氨酸，直接就可以爬片，你要查查你的细胞究竟有什么特效。不过大多数都是用多聚赖氨酸来做细胞爬片。

作者: gandanxiaoyang 时间: 2010-9-20 14:49

贴壁细胞比较好做。载玻片清洗干净后高压灭菌，置于培养板底部，直接接种细胞就可以了。为增加黏附能力，可以涂多聚赖氨酸等试剂。干细胞球相对麻烦一些，可直接将其置于玻片上，待培养液干的差不多时，干细胞球即贴于玻片上，可做相应的实验，但缺点是不太牢固，部分干细胞球会脱落。

作者: syl82 时间: 2010-9-29 10:21

回复 8# prettybear 3 P9 Q. _, S7 c; x

) S, X& D: b6 s/ s0 t3 i
铁壁细胞直接爬片就可以了

作者: mhm 时间: 2010-10-19 17:44

要是做免疫细胞化学，细胞本来就自己会贴壁，不涂粘附剂也可以。

作者: djj01 时间: 2010-10-19 18:27

不同组织来源的细胞情况不同，不过多聚赖氨酸比较常用是个不错的选择！

作者: smallboar 时间: 2010-11-20 22:19

不如拿细胞团块来切片 a3 w6 o! Y* b9 A
kuangxiaocong 发表于 2010-1-30 09:03

7 I1 F% w9 ~* }5 \1 e' q& q N
* m, j! N' M: ~, {- @1 [6 x

请问，“细胞团块切片”具体怎么操作呢？

作者: 龙之吻 时间: 2010-12-21 21:31

第一，盖玻片需过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。两张或者以上的玻片很容易为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当一张，一定看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不接触纱布，否则会粘上毛毛的。然后压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。0 A8 W. ~+ C) d4 l( O# D9 L3 C
第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。这一步至重，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。
第三，传代消化下来的细胞一定不过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。
第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。
第五，将玻片拿出后一定记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切长方形的。目前市售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。可以用小砂轮切一下改长方形，至在某个角上用砂轮做个记，理论上很简单，实际操作有难度。 ^. y& _; C! y7 H+ n
第六，上面步骤都没问后，玻片就需进一步处理了，这里有几个细，分述如下：
1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！
2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。我发直接用4°C的溶液会造细胞冷休克，从片上脱落。
3.用中性树胶粘盖玻片与载玻片时，尽量少滴树胶，一点点就够了，而且至少半个小时以上才能粘牢，防止在水中脱落。否则盖玻片就会移动，背面会出树胶的印子，镜下很难看，而且擦不掉的。$ D5 j8 ~) D7 y6 W! E
4.固定好的片子放到冰箱中保存，我倒没怎么试过，我基本上做好的就直接做免疫组化。

多聚赖氨酸，这个在爬片中比较常用，可以根据需要调节浓度。细胞表面及细胞外基质中的FN分子间通过二硫键相互交联，组装成纤维。纤粘连蛋白与胶原不同，FN不能自发组装成纤维，而是通过细胞表面受体指导下进行的，只存在于某些细胞（如成纤维细胞）表面。转化细胞及肿瘤细胞表面的FN纤维减少或缺失系因细胞表面的FN受体异常所致。

作者: lsp_318 时间: 2011-1-15 14:20

对于悬浮细胞该如何爬片啊？做了2天，结果发现原来已经贴附于盖玻片上的细胞，后来全掉了，欲哭无泪

作者: ruochenzu 时间: 2011-3-20 17:56

芯片屋里的李姐姐做爬片做的可好了: p6 Y4 f, [) `$ l; s+ Z
火云豹，直接去问问吧

作者: wang_kai1212123 时间: 2011-4-2 23:40

我做的是贴壁细胞爬片，0.1ml含有104个细胞，滴在载玻片上，培养箱放置4个小时后，细胞贴壁，然后在超净台内处理，放入6孔板内培养，待生长到80%时候，既可以处理使用，做免疫荧光染色或者免疫组化。

作者: 王乾 时间: 2011-4-22 18:18

用明胶就行，多聚赖氨酸据说有一定的毒性，用不好细胞会死很多。

作者: kevinaoo 时间: 2011-5-12 19:18

看看

作者: yxc 时间: 2011-6-25 16:57

最常用的是多聚赖氨酸，它对各种细胞都有增强贴壁的作用，所以Cells can also be plated on poly-L-lysine-coated plastic to determine 100% attachment.

作者: ycjzyh 时间: 2011-7-15 01:53

前一阶段在师兄的指导下做过，贴壁细胞就是将消毒好的载玻片放在孔板里，然后将所需浓度细胞移入培养；悬浮细胞是滴到载玻片上，4小时以后就可以继续后面的步骤，这个细胞要多种一些，会掉，但是不太影响。

作者: haoxiangshan33 时间: 2013-5-7 17:53

回复 sunnyhuimin 的帖子/ w3 x b7 Q& c- T- I3 E) H0 j% Z
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请问你做间充质干细胞，你细胞爬片的时间是48h,那你接在玻片上细胞密度大概是多少啊？

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