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标题: 请问体转干的四个转录因子在细胞质中存在吗？ [打印本页]

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-1-29 19:49 标题: 请问体转干的四个转录因子在细胞质中存在吗？

请问这四个因子的蛋白在胚胎干细胞的细胞质和细胞核中都存在吗？他们在细胞质和细胞核中是怎么转运的呢？谢谢

作者: anminleiryan 时间: 2010-1-29 20:44

我想，细胞质内是应该存在其前体的；因为蛋白质的翻译必须在细胞质内通过核糖体进行，经过加工后，这些转录因子重新返回细胞核内发挥功能

作者: anminleiryan 时间: 2010-1-29 20:45

回复 2# anminleiryan
5 n& n$ {; {( `( [6 }3 B: W
至于他们在细胞质和细胞核中是怎么转运的，你只能通过自己有目的的查资料寻求答案了

作者: 军医 时间: 2010-1-29 20:56

学习了

作者: qizhi502 时间: 2010-1-29 21:06

尽然命名为转录因子就是在核中存在了。蛋白合成是在胞质中的

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-1-30 01:22

谢谢大家！还想问一下，我将原核表达的这四个因子的可溶蛋白导入到细胞质中，核膜附近，可以发挥生物学功能吗？

作者: ghfvcat 时间: 2010-1-30 10:39

回复 6# 胡鹏飞

你是怎么导入的？转录因子入核才能发挥作用，丁盛有做过这种工作，蛋白诱导IPS

作者: msliyv 时间: 2010-1-30 11:49

这文章里好像没有提到用什么方法将蛋白导入细胞的。
0 n$ o* x# |( G: Y5 V. o7 L8 o
至于转录因子进核的问题，我倒不觉得是个问题。因为内源的Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc表达时也是在细胞质中表达然后通过细胞自己的机制导向到核内。所以只要以合适的方法将四种因子的蛋白导入细胞质，有很大的可能这些蛋白会被运送到细胞核。

另一个问题是你用原核表达的蛋白有活性吗？你如何鉴定他们的活性？

回复 7# ghfvcat

作者: ghfvcat 时间: 2010-1-30 12:11

[attach]4045[/attach]回复 8# msliyv ' J A: K) s q5 n
1 E7 }8 P& [* |# j# s) L( Z
) r- g& H6 V1 i7 j8 q. B7 R- V
他用的是polyR融合蛋白，另外还可以用TAT融合，都可以进入细胞核。+ B# @* G& d3 N2 C! D X3 b
至于有机制导向到核内，我觉得在细胞外合成的蛋白导入细胞后并不一定可以起作用。以为细胞定位是在合成的过程中就决定了的，也许还涉及一些定位序列，而不是在合成成熟的蛋白之后才决定。
至于活性，这个问题不太好检测，我也不知道有哪些方法检测蛋白活性，貌似都是从功能上检测的，但这些因子不知道怎么检测，只能是认为可溶状态就是有活性的了。欢迎高人指点。你要有钱的话可以试试做晶体，哈哈: }$ X6 @, v1 h& h9 S- l
导入蛋白的方法，你可以参见下面这篇文章

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-1-30 13:44

我先导入的TAT-EGFP融合蛋白，但是细胞核里面没有，都在核膜周围聚集，这是什么原因呢？

作者: ghfvcat 时间: 2010-1-30 14:58

时间太短？照片呢，传上来看看啊

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-1-30 17:01

孵育了两个小时，细胞核里面没有，只在核周围聚集着

作者: msliyv 时间: 2010-1-31 02:07

再仔细看了看这几篇文章，采用代tag的融合蛋白导入确实不失为一个方法，如果先不考虑tag本身的影响的话。

Ding的文章用的也是原核表达系统，如果他能做出来，那么证明原核表达应该不是问题，或者说对这四个因子来讲转译后修饰并不是活性所需要的。

楼主发现蛋白只在核膜周围不进核可以考虑一下蛋白降解和蛋白错误导向的可能性。同时用细胞器染料看看6 e, i5 E1 f. c d
具体是在什么compartment，比如Golgi，rER，endosome，还是lysosome等。这需要用到Confocal microscope 或者EM

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-1-31 14:16

我用共聚焦照的，可以肯定都在细胞核周围，别的地方荧光几乎没有，难道是蛋白降解了，还是蛋白的核定位序列没暴露出来呢？我纯化的蛋白是表达的可溶蛋白，不是包涵体，做过一次包涵体的纯化，但是连细胞膜都没进去

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-1-31 14:17

我用共聚焦照的，可以肯定都在细胞核周围，别的地方荧光几乎没有，难道是蛋白降解了，还是蛋白的核定位序列没暴露出来呢？我纯化的蛋白是表达的可溶蛋白，不是包涵体，做过一次包涵体的纯化，但是连细胞膜都没进去

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-1-31 14:23

我还想问一下：我的包涵体透析后都是絮状的，透析液是含10%甘油的PBS，怎么将絮状的包涵体溶解后加入细胞培养液中呢？

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-1-31 14:26

我表达的可溶蛋白透析后正常，但是进不到细胞核

作者: ghfvcat 时间: 2010-1-31 15:15

回复 15# 胡鹏飞 7 X% X/ S; ]+ V8 i8 b. _+ R4 v
. H' F! o: M! ^* c9 @/ s; k

我觉得尽量避免包涵体表达然后复性，本来活性就没法检测，复性后就更不好说了，加长孵化时间看看

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-1-31 17:02

孵育了12小时仍然进不到细胞核

作者: zlightmiss 时间: 2010-2-1 14:03

回复 10# 胡鹏飞 + v$ Q( \7 {- U) {; f

& C6 [% c) n6 x" W) \" o
可能表达出来的蛋白的三维结构不正确吧....

作者: msliyv 时间: 2010-2-1 22:26

回复 14# 胡鹏飞 " ~7 a0 q+ q# e
" G+ C( Y# ?4 s: c
我已经了解你表达的蛋白全部到了核膜附件，但是核膜附件的细胞器很多。我的意思是你可以加一些细胞器的染料，比如你表达的蛋白如果是GFP，那你可以用红色荧光的细胞器染料，这样你就可以通过confocal知道你导入的蛋白到底是在什么细胞器中。这对你了解问题所在很重要。已其猜测结果还不如进行这样一个简单的实验看看。* j" O, |& a3 P; {9 |/ R
: v3 `+ g) r$ b4 S# S/ g5 K& ~/ ]7 }$ z
如果你发现蛋白在lysosome中，那当然是降解了，如果是在ER等内膜系统，那非常有可能你的tag没有暴露出来或者设计有问题。

希望对你有帮助。有结果也希望告诉大家，这样大家可以一起学习。

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-2-2 15:42

谢谢您的指点

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-2-3 00:36

我用的细胞是反复冻存复苏的细胞，冷冻对核膜有什么影响呢？

作者: msliyv 时间: 2010-2-3 02:37

回复 23# 胡鹏飞 ; `8 J" w/ |" ]" O9 B2 b/ }

没有，不应该

作者: 胡鹏飞 时间: 2010-2-4 04:00

我想了想虽然我做的穿膜肽-EGFP融合蛋白只能导入核周围进不去可能是体外原核表达的蛋白空间结构的问题穿膜肽的核定位序列没完全暴露出来但是我想这四个因子应该都有自己的核定位序列它既然进入了细胞质也有可能靠自身的核定位序列自己进入核中发挥作用因为快毕业了我想按原方法往下做大家觉得我的想法可行吗？希望大家多给点意见，谢谢

作者: ghfvcat 时间: 2010-2-4 20:51

回复 25# 胡鹏飞 ) J4 w" H; w$ z; |- N" n0 k
. V0 u+ f% J4 _2 M2 { J( j* X, t

蛋白诱导IPS么？试试吧，反正IPS诱导是要等的，我不觉得是这个问题，以前有人做的GFP好像可以入核的，

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