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标题: MSC诱导分化专题 [打印本页]

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:19 标题: MSC诱导分化专题

样本:: K. f  r5 m0 g9 x) m( h
MSC向成骨细胞的诱导分化
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；# e3 x- C  M9 K- |
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
(3)2w后进行茜素S染色鉴定。8 G9 F4 |- R6 D* S
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；9 g+ f! Z7 k' l( W7 m
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。4 S1 J) |9 [6 ?: m; M; |
MSC的成骨和成脂肪的检测
茜素S染色方法4 F, g  M  `2 ]3 G5 ^
(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
苏丹Ⅳ染色方法
(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；$ b" R0 `7 e5 Q  @
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:20

成软骨细胞的诱导
选前三代生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
种于细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察。14 天后终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。& K6 N- f# g j/ c; d. P
软骨细胞诱导液:$ \" U/ H) T `& u- ?0 f
DEM E 高糖培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF, v# {; b9 d! d3 T- b
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:20

体外诱导MSCs向神经细胞分化* J; g7 Z @& D4 u
体外诱导MSCs向神经细胞分化8 A/ {1 N& Y4 w4 c
取体外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs, g( a) S/ f# U5 E; Z
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:21

选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。: g# g0 I' D* u$ O
茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍；加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。

成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。7 h/ R/ N* [3 g: R7 a- v: _" b
油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:21

肝样细胞诱导分化[1~3]( K+ B! }6 `0 h& [8 i
DMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达7 |/ X4 x9 V4 X, S- `

1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:21

2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化6 H! [9 A% a! H- L$ L, D3 M2 R
2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞* w( }+ i1 m* A3 q7 b
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
茜素红S染色法步骤：
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次0 s/ W$ P# ?; s) c0 g3 S
(2)茜素红染2min。* t# Q9 X" B1 b8 s# R5 V
(3)蒸馏水洗5-10s。- S9 i5 _2 o$ V/ |8 Z# T4 R7 _
(4)分化液洗15s。
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成# c& Q6 v: \& {. A
油红O染色法步骤：
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
(2)4%多聚甲醛固定15 min;
(3)PBS漂洗两次，每次5min;
(4)入60%异丙醇漂洗。
(5)入油红O染色15分钟。1 |) c ~6 N4 X& P
Devil60%异丙醇漂洗。9 J( O& [. |# H- S7 u
0 U6 O2 v8 K* `& X3 J" c; }% q% [
3.rMSCs成肌细胞诱导分化
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:21

新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC2 @$ z8 y. O- K# [9 g0 `" e
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。$ V1 @# I1 }. B& N$ N, P7 \, U
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。- ^* K. j. m/ [! [, x; ^+ Q
7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。2 i2 C/ y( Z; [- O x% j% G2 Y" U
二、诱导分化实验：
取PP6进行诱导，采用两种方法：
- z4 a: y2 Y- Y( I, S% V- y
1、共培养诱导：/ D. [* J& ^& A' T) _. _" W
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。# @& ]% w5 I# b& x6 {7 d n
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。6 f( x, P% q% R5 T- X6 A
2、直接诱导：$ g' r! [# s% d/ q$ k. \
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。3 t0 h4 X8 _+ W. u$ X+ H* u
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。% ?" Q5 f" S, F0 |" U

增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG

Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:22

CD34+CD38-的干细胞向粒系的诱导分化:
细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,0 e0 H$ y0 A) \
GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:22

脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞- J# |5 G* Z" z  l8 }
0 p! I4 T/ q2 h! b  i/ H
1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。

2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。* `6 }: m! N1 ~' I+ {4 J8 c$ Q" V! v" x
: {- V. _) H" |  E0 S* D7 \
3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。( o$ J3 k/ }: w. j; b3 Y2 s7 d' N
6 \: Z" O: W' B- v; c
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。0 y4 \& m9 t( e* ^* P* }6 |

5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。0 i' U, J4 g" z" {+ h

参考文献：
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.4 j. D. E5 o/ E( E$ l# r7 g
2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:22

zeronepl6 d# z4 T1 o* p& k2 N
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化& j) D5 L3 C& d
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化' K0 N6 s8 _- k- E. E* h# ?" n
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。* J: l( H# T# S4 D* {0 _- D
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化$ U) l& G# a+ i3 e
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化, g8 A" k+ q* |: f2 U; r
诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化5 |5 N1 H$ q! p! {
诱导剂主要有5-氮胞苷。
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化 D/ X) W2 e; f
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:23

胰腺干细胞（SP细胞）向胰岛β细胞的诱导分化; ?2 \3 [/ v! ]
1.实验对象，选用3-7个月流产胎儿，实验选用的培养基是1640，并加入10.0 %的 FBS 和2%的双抗。
2. 胰腺干细胞的原代培养方法：用眼科剪将胰腺组织剪成1-3mm3大小，200U/ml胶原酶Ⅴ在37度消化5分钟，然后用冷的HBSS洗涤俩次，在培养瓶中放入含有10%的胎牛血清，10mM Heps，1mM 的丙酮酸钠和71.5uM β-巯基乙醇的1640培养基中。96h后,吸出悬浮的胰岛样细胞簇(ICCs),培养在一个新培养瓶中,换上新的培养基,添加20ng/ml bFGF和20ng/mlEGF，在24小时内ICCs贴壁。) x( E3 w9 q8 f0 g! X
3.Hoechst33342染色：细胞传六代后，选用对数生长期细胞，实验前一天换液一次，弃去旧培养液，PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化液1ml，镜下观察细胞变圆，加入含血清培养基中止消化，吸管反复吹吸数次，脱壁形成细胞悬液，移入无菌离心管，计数，室温1000rpm离心，用含2%小牛血清的的1640培养液重悬成106/ml细胞悬液。细胞分为两组：
一组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml；
二组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml+维拉帕米至终浓度50μg/ml。# |2 X- ?1 b0 I3 ?# c
37℃ 水浴90min，每15min混匀一次，冰浴冷却，4℃离心，弃上清，用含2%小牛血清的PBS洗一次，重悬于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，两组分别加入PI至终浓度2μg/ml，细胞过滤网过滤制成单细胞悬液后，立即流式细胞仪分析。在左下角可见一群细胞两种荧光强度均很弱，即为SP（side population）亚群。
4.单克隆SP细胞的培养和分化：单个的SP细胞和非SP细胞通过FACS被分选到96孔培养板，用上述培养基加 bFGF和EGF培养。培养七天后测定克隆形成。集落被迅速的传代，当这些细胞在传到第十代时，对其进行诱导分化。在诱导中，加入诱导液Ⅰ：无血清培养基 +100pM HGF+2nM activin A（苯丙酸诺龙）+500pM betacellulin（beta 动物纤维素）+10nM exendin-4 （胰高血糖素样肽）+10mM nicotinamide；当80%细胞融合，更换低糖培养基，细胞被进一步培养六天。1 |1 b& J5 V& H+ X. L+ R C H
5.当细胞铺满瓶壁，加入制备好的DTZ工作液，37℃，培养15min。PBS缓冲液冲洗，显微镜下观察。若胰腺干细胞已诱导分化为β细胞，呈棕红色。染色完毕，加原来的诱导培养液，5h后，棕红色消失。

参考文献ing Zhang, Jiang Hu, Tian-Pei Hong,et al. Monoclonal side population progenitors isolated from human fetal pancreas.9 b5 [2 K' @8 J1 R0 J
Biochemical and Biophysical Research Communications 2005, 333 ,603–608.

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:23

deathdriver( o a+ ^( k$ C: t+ b) ~
我们实验室的前辈做过向成骨、成脂和成内皮方向诱导，引用一下他们的方案：
Osteogenic differentiation.6 C) c+ D2 N; { Q& c B' E
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced in the following osteogenic medium for 2–3 weeks: Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, 10 mmol/L b-glycerophosphate, 107 mol/L dexamethasone, and 0.2 mmol/L ascorbic acid (all from Sigma). Then the cells were stained with von Kossa to reveal osteogenic differentiation.
Adipogenic differentiation.
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced for 3 weeks in DMEM supplemented with 10% FCS, 0.5 mmol/L hydrocortisone, 0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine, and 50 lg/ml indomethacin (all from Sigma). At the end of the culture, the cells were fixed in 10% formalin for 10 min and stained with fresh Oil red-O solution (Sigma) to show lipid droplets in induced cells.
endothelial differentiation of ADAS cells.: `: Z4 N9 O+ b* |! j1 ~
To analyze in vitro endothelial differentiation, a 24-well cell culture plate was coated with Matrigel (8.8 mg/ml; BD Bioscience Biotech.) in each well. ADAS cells were suspended in endothelial differentiation medium at a concentration of 1×105/ml and 0.5 ml of cell suspension was added to each well. Differentiation medium contained medium 199, 50 ng/ml VEGF, 10 ng/ml b-FGF, and 3% FBS. Cultures were incubated at 37 C in a 5% CO2 humidified atmosphere for 2–3 days observed with an inverted photomicroscope

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:23

MSCs向神经细胞的定向诱导分化
MSCs向神经细胞的定向诱导分化
+ c9 O! F7 @3 m
一 MSCs的培养和纯化2 C% T- a, s+ N* j0 s
二 MSCs向神经细胞的定向诱导分化# l( [' R+ Y$ R, T9 ]
传至第5代的MSCs按1x104/ml浓度接种于铺有2玻片的6孔板中，制备细胞爬片，培养液改用DMEM+20%胎牛血清，待细胞融合达90%后，吸出培养液，用PBS清洗细胞两遍，后分别加人以下诱导剂:MT(10mol/L)、bFGF(20ug/L)、M组不加任何诱导液。逐日观察细胞形态变化，并分别于3、6、9、14天取出细胞爬片作NSE及GFAP抗原鉴定。
三诱导细胞的免疫荧光法鉴定7 M* l' @3 `/ q' A
免疫荧光法详细步骤如下
①将细胞爬片取出后用PBS轻轻漂洗3次，每次1/2-1min;
②甲醛固定30min，PBS漂洗，每次5一10min，共3次；
③用0.4%Trixton-100透化15min。
④10%BSA封闭1小时。) _: k) s6 B" ?, L5 [! [/ v& ]% D7 F
⑤于盖片上加1:200PBS稀释的一抗(NSE、GFAP)，室温孵育1小时。PBS漂洗3次，每次10分钟。
⑥避光室温下加1:100稀释度的荧光二抗孵育1小时，避光下PBS漂洗3次，每次10min。ddH20洗1次，5min。 d+ k4 R8 S/ ^/ z7 Z) o9 e+ M
⑦95%甘油(ddH20稀释)封片。- ~( V z8 ]) b% q( G
⑧荧光显微镜下观察结果并拍摄照片。

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:23

贡献一下我的向造血分化的培养体系：* ], P* U# `( j9 J9 e, n5 R2 K
造血干细胞的诱导培养
试剂：" V6 ^6 {0 o0 L" r- m6 B$ E+ D" e
1.  淋巴细胞分离液
NaCl  4g
KCl  0.1g
KH2PO4  0.1g
Na2HPO4-12H2O  1.425g
2.  PBS 500ml$ t( R" Z) g' c( e- G( f
2 H. z5 `$ [4 |1 i4 _* U: G6 y
3.  进口胎牛血清0 S6 ]% d- V7 J- r
4.  IMDM培养基
5.  2.7％甲基纤维素
  配制方法一2 D+ n: @1 ^1 \0 T7 @) ]3 r0 p$ ]1 p( X
1)将甲基纤维素6.75g平铺在直径为10mm的培养皿内。
2)用紫外灯照射甲基纤维素24h后，在无菌条件下，将它放在烧瓶中。
3)加消毒过的双蒸水125ml，充分振荡30～60min。
4)置4℃冰箱内24h。气泡消失。0 I: o- u; v5 G3 O' s
5)加双倍浓度培养液125ml。
6)加10％NaHC03若干调节pH至75 _' Y1 b8 y- L1 n$ H
7)分装若干小瓶备用。. }, m5 U- _0 `) x$ H' W4 H' S
  配制方法二（多选此方法）
1)称取甲基纤维素6.75g，放在500ml三角烧瓶中。
2)加双蒸水125m1煮沸。用磁力搅拌器不断搅拌使甲基纤维素充分混匀。
3)继续煮沸15～30min后，置室温下冷却。) e( E3 f+ X" M+ e" h) t5 v
4)加双倍浓度培养液125m1，反复振荡。
5)置4℃冰箱中。约每隔10min振荡一次，2h后置冰箱(—20℃)中冰冻过夜。
6)从冰箱取出后于室温融化，分装。于4℃冰箱内保存备用。: ~3 a! o* j5 U
6.  牛血清白蛋白组份V2 ^0 f) e" M# G) P3 j
牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)主要用于红系、巨核系和混合集落的培养，加入一定量后能明显增加培养效果，但配制不当就起不到这样的作用。一般工作浓度为10％。
(1)主要材料：包括：①牛血清白蛋白，纯度为98％～99％，不含主要脂肪酸和球蛋白，含氮15.6％。可选用Sigma公司编号为A-7030的产品；②混合离子交换树脂AG501-x8(D)；③Dulbecco磷酸缓冲液(2倍浓度)；④双倍浓度培养液；⑤G-5漏斗或孔径为0.45μm／ml 的微孔滤膜；⑥双蒸水。
(2)配制步骤# c6 \' `/ g; t7 J3 t) ~6 h
1)将5gBSA用9.1m1蒸馏水在离心管内溶解。用磁力搅拌器搅拌，经2～3h后才溶解。# G6 `  X' [) m4 |: w/ I
2)将1g AG501—x8(D)加入离心管内，置4℃冰箱内，每15min搅拌1次。2h后离心，取上清液。或再加1gAG501-x8(D)，重复离心1次，直到离子交换树脂不变色。- Q  s9 U0 }4 h% k0 |% o
3)用Dulbecco磷酸缓冲液(2倍)稀释至10％。' {/ G& P( _) ~/ M$ |% @  s8 L/ r, T
4)用G-5漏斗或微孔滤膜过滤除菌。) S; L0 T1 U8 h, a' w' C2 Y
5)再在每20m1 10％BSA中加入0.5m1 7％的NaHC03和0.2ml 3％的谷氨酰胺。
7.  β－巯基乙醇：1000×8 J' h1 Q) t: }
8.  双抗：500× 每16ml需要青霉素80万单位，链霉素800mg 即青霉素5万U/ml，链霉素50mg/ml
9.  Gln： 100× 每100ml需要2.927g Gln: C" R; m; u( l9 R" |& x
10.  IL-3：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml
10mM乙酸：取12μl纯的新开封的冰乙酸加20ml灭菌纯水混匀后过膜除菌，置于4℃( V: e+ z! Y3 I: C, y! z' o( H
11.  IL-6：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～0.5mg/ml（轻摇溶液使之更好的溶解）. j, T$ F) \' S; V. R3 h* Z% E8 e5 X
12.  SCF：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml
13.  EPO：用含至少0.1％的人/牛血清白蛋白的PBS重溶至终浓度大于500μ/ml
14.  G-CSF：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml
: ?4 b( u' R6 A: `  w
细胞因子的配制1 O& j7 r/ s& ]3 y
- R1 ]% G: F; C, t
细胞因子  储液浓度  储液配制  稀释倍数  终浓度' ^6 V1 I4 e7 I$ }7 b* X/ L  ^. V
IL-3  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  50  2ng/ml
IL-6  0.1mg/ml  5μg加50μl 10mM乙酸  5  20ng/ml+ q' ~- c; w4 P0 w* R
SCF  0.1mg/ml  10μg加100μl 10mM乙酸  0  100 ng/ml
EPO  500U/ml  加900μl PBS及100μl 1％的用PBS配的BSA  0  2U/ml
G-CSF  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  10  10ng/ml

IMDM-甲基纤维素半固体培养基的各组分终浓度

IMDM培养基  30％
进口胎牛血清  30％
甲基纤维素  0.81％
牛血清白蛋白组份V  1％* \: Z: _( H6 ]
β－巯基乙醇  0.1mM' J( D$ L( i+ d9 Q4 l. k
青霉素  60mg/ml7 f5 n; G2 t3 p. {) M: g
链霉素  100mg/l) v+ D9 n& g! @' e
IL-3  2ng/ml! I' Q- x! J. v; l, J/ f
IL-6  20ng/ml
SCF  100 ng/ml
EPO  2U/ml
G-CSF  10ng/ml$ O. S1 d5 S, C9 z3 {1 |$ \# l1 j
Gln  2mM
, `, _! V+ N7 M' k( e/ T3 e! F
诱导（5ml体系，可以铺两个30mm的培养皿）& G5 O: }5 r( `7 Q. O& h# _- d

向红系诱导  向巨核系诱导  向粒系诱导
IMDM培养基  1.5ml  1.5ml  1.5ml
进口胎牛血清  1.5ml  1.5ml  1.5ml
10％牛血清白蛋白组份V  0.5ml  0.5ml  0.5ml  m' }0 r1 f) |8 b
1000×β－巯基乙醇  5μl  5μl  5μl  m) G& b3 L2 e( ?2 r. e" m
IL-3  5μl  5μl  5μl  w/ Y4 C" Y+ _( Z6 D; q
SCF  5μl  5μl  5μl
EPO 20μl
IL-6    5μl  7 a+ J. J  u4 m( u5 n' P
G-CSF       5μl- ~, d& v! D; k" k
100×Gln  50μl  50μl  50μl. M& h; {2 _8 i# A% u
500×双抗  10μl  10μl  10μl$ o9 g$ {# c# `- x, L- E! b
2.7％甲基纤维素  1.5ml  1.5ml  1.5ml

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:24

骨髓基质干细胞诱导分化为雪旺细胞培养
1．以无造血系统疾病的成人志愿者为对象，无菌条件下抽取骨髓4 ml，DMEM常规制成细胞悬液，梯度密度离心后，以1×10／m1个细胞接种于25 ml培养瓶，37度，5％CO2饱和湿度条件下培养，待贴壁细胞达90％融合后，以
10 5／ml接种传代。+ m. V0 y Z& X+ p6 e& j
2. 诱导培养去除培养液，加入预诱导液(DMEM，15％FBS，1 mmol／LBME，10 ng／ml b-FGF)诱导24 h，加ATRA，BDGF诱导3 h，加Heregulin，Forskolin，b—FGF，PDGF 37度、5％CO2,饱和湿度条件下诱导5 d

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:24

成肌诱导
2 或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。; F6 Q8 c% V" ]! D8 n1 y
1 m8 V: u9 y# k$ d s: ?
内皮诱导
24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:24

脐血干细胞向软骨细胞诱导分化
选第5-7代生长良好的培养细胞，置于15 ml的聚丙烯管中，1000 rpm离心5 min，弃上清，,加入含血清软骨诱导液的培养基进行细胞诱导培养。! V S7 [ E# |/ M; ?
不同学者采用的培养基和软骨细胞诱导液有所不同，Oscar K等在H-DMEM培养基中加入1μM地塞米松，50 μg/mL抗坏血酸，100 μg/mL丙酮酸钠，40 μg/mL脯氨酸，10 ng/mL TGF-β1和50 mg/mL 预混的ITS＋（含6.25 μg/mL 胰岛素，6.25μg/mL 转铁蛋白，6.25 ng/mL硒酸，1.25mg/mL牛血清蛋白和5.35 mg/mL亚油酸）。Gang E J等则在L-DMEM培养基中加入1mM丙酮酸盐，0.1mM抗坏血酸盐，100nM地塞米松，预混的ITS＋和10 ng/mL TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。预混的ITS＋的成份及浓度跟Oscar K相同。

作者: dfe77 时间: 2010-1-31 13:24

羊水来源干细胞诱导分化/ N* \  d4 N! j
1、羊水来源间充质干细胞# P- d0 ~) y) W8 F0 h. Q+ t+ @
地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞) }" N- C! X6 D! R0 J" L
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐导其分化为成骨细胞# H* \1 z: _  N5 u! l
成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇诱导其分化为神经细胞

2、HAFFTs（human amniotic fluid fibroblastoid-type cells）
地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞/ a7 b/ b- [8 \0 ?0 {0 H4 s: H
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β等诱导其分化为软骨细胞, [& U) ]0 s3 o
bFGF、EGF、二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚、KCl、丙戊酸和氢化可的松诱导其分化为神经细胞。
6 F. {  @; d7 |. ?) X
3、amniotic fluid–derived stem (AFS) cells  z) U% B( d0 ]. b0 q9 W! }8 V
地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞/ P. R/ j" g- {$ l
地塞米松、β-甘油磷酸盐、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞
5aza-脱氧胞苷酸诱导其分化为肌细胞
内皮细胞培养基+bFGF诱导其分化为内皮细胞/ y/ R. t  v; @6 g# s$ v! ^7 w
二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚和NGF诱导其分化为神经细胞
二羟基丙硫醇、HGF、制瘤素M、地塞米松、FGF4和ITS等诱导其分化为肝细胞0 ~% f. G8 L6 m
1 d: a2 S+ |. L" V4 F
参考文献：- ?# D# O; `6 Y+ M
1.Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, et al. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum. Reprod. 2004 ,19；1450–1457., o7 E+ E1 G$ E" Z
2.Kim J, Lee Y, Kim H, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multipotent stem cells. Cell Prolif. 2007;40:75-90.
3.Coppi PD, Bartsch G, Siddiqui MM, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotech. 2007,25:100-106.

作者: yuheng 时间: 2010-2-1 16:27

dfe77 战友辛苦了，这些很有用。" Y7 a1 x7 I1 a
& b# f; D2 }5 T( Q% u
如果再结合自己的实验结果和心得就更好了

作者: kqyy 时间: 2010-2-3 19:20

xuexiliao

作者: missyoudad 时间: 2010-3-19 19:56

学习了

作者: missyoudad 时间: 2010-4-25 23:12

谢谢

作者: viva 时间: 2010-5-1 17:09

ding---------------

作者: wsrz 时间: 2010-8-4 15:56

不错，学习了

作者: yinxiangyu6666 时间: 2010-8-4 18:59

回复 24# wsrz
! J+ l% Q9 Y2 Y9 ~
0 U9 m/ O6 {" c( z' p$ g, Y
成骨诱导能否附上几张图片，这样就更直观了！谢谢

作者: lchanlon 时间: 2010-8-5 10:24

非常感谢！

作者: 2008225027 时间: 2010-11-11 15:15

回复 6# dfe77
3 S$ z' v; T# V8 a5 {4 U/ {
, ^$ S- s W5 s! p. h
您好，请问能麻烦您把这篇文章发到我的邮箱吗?我们学校下载不了，非常感谢哈! 邮箱:262940988@163.com1 |& @1 I, v9 V- t* w- R
1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

作者: 2006goodluck 时间: 2010-11-15 11:21

marker

作者: 哇牛 时间: 2010-11-19 15:26

有没有脐带间充质干细胞向心肌细胞诱导分化的方法及步骤（有没有自己亲手做成功的）

作者: zsh539 时间: 2010-11-24 15:39

楼主很强大！我的是BMSCs向软骨细胞诱导分化，收藏啦，好好研究一下！
谢谢分享！

作者: xiaodiao123 时间: 2010-11-25 14:11

谢谢啊

作者: 生物化学zy 时间: 2011-4-15 00:19

学习了,楼主,谢谢.

作者: 生物化学zy 时间: 2011-4-15 00:21

顶,楼主

作者: 岳叶丽 时间: 2011-4-22 09:33

好贴，学习了

作者: alioli 时间: 2011-4-22 23:12

MSC的成骨诱导还有一种经典的方式是采用BMP-2单一因子进行诱导，但是价格略为昂贵。

作者: 骨道边 时间: 2011-5-2 23:37

有没有向软骨方向诱导的啊

作者: 临床干细胞 时间: 2011-6-11 10:36

dfe77兄还在吗，有问题请教

作者: hhh625128 时间: 2011-6-17 10:55

好人，辛苦了

作者: peachfang 时间: 2012-3-19 20:26

有没有往上皮细胞分化的方法

作者: peachfang 时间: 2012-3-19 20:27

如果要自己设计诱导，怎样选择诱导剂

作者: henryjia 时间: 2012-3-20 00:34

thanks a lot!

作者: 湖南干细胞 时间: 2012-11-5 08:34

很值得学习的帖子，顶一下。

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