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标题: 如何将胚胎干细胞和支持他生长的饲养层分离开来？ [打印本页]

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作者: mominglily    时间: 2010-3-17 17:05     标题: 如何将胚胎干细胞和支持他生长的饲养层分离开来？

对胚胎干细胞做毒性测试，怎样将胚胎干细胞和支持他的饲养层细胞分开，以使加到96孔板中的细胞是纯粹的胚胎干细胞而不夹杂较多的饲养层细胞？
( R' t$ B5 ~1 E+ |) B请教各位，谢谢！

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作者: 待鹤    时间: 2010-3-17 17:24

使用MEF来源的条件培养基代替feeder。
' r" Z& |$ L! f, D4 K条件培养基制作方法如下：
* C6 q! Y1 V) i* iPreparation of MEF- Conditioned Medium (MEF-CM)& b, o6 R4 \. |1 u" ?  I
1. Plate 4 x 106 mitomycin C treated MEFs in a T75 Flask coated with 0.5% gelatin, in complete MEF medium.
) n& Z% ]. H$ m3 p2. The following day, replace the MEF medium with 37.5 ml 20% KSR hESC medium containing 4 ng/ml bFGF, and incubate for 24 hrs at 37°C, 5% CO2.1 @5 D0 q6 x* u+ d
3. Collect MEF-CM from the flasks after 24 hrs and 0.22 μM filter sterilize. MEF-CM can be used fresh or can be frozen.
* N: B$ d& X" X. Y7 H* F4. Add fresh 20% KSR hESC medium containing 4 ng/ml bFGF to the flasks., D" X$ [, r# v+ i. d5 d& P- ^
5. Collect MEF-CM for up to seven days using this procedure.
* l; o2 P, k- z7 i  _" w4 M6. Depletion of L-Glutamine and bFGF from the MEF-CM is assumed, and L-Glutamine (to 2 mM final), and bFGF (to 4 ng/ml final) are therefore added back prior to using MEF-CM with hESCs. Freshly thawed ß-Mercaptoethanol (ß-Me) is added to 0.1 mM final fresh each day of use.

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作者: 待鹤    时间: 2010-3-17 17:33

这儿还有Nature上的一篇protocol。
, W4 N: a, _: x# T0 SFeeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.pdf
% c: i& S, v/ K0 e- x5 K' j[attach]4929[/attach]

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作者: mominglily    时间: 2010-3-18 17:37

万分感谢，我先下载来学习下，但是目前我们在做的是含有饲养层的mES细胞，就想寻找针对有饲养层细胞的方法。

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作者: czzhaozhu    时间: 2010-3-19 10:38

对于mES细胞和MEF feeder如何分开来，我们实验室一般采用差速贴壁的方法，MEF feeder1h左右在明胶包被的皿上有70-80%贴壁，而ES细胞基本不贴。

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作者: mominglily    时间: 2010-3-19 14:10

回复 5# czzhaozhu
! ^' }% E$ r) l4 t3 y1 a+ k4 n* g2 e, ~/ `2 B2 s( s1 G- W
0 T" W' B; g6 i
    谢谢您！我自己也打算用这种方法来做，但是是否必须选用和原板面积一样大的板来爬呢？用较小一点的面积的板可以吗？！~还有就是爬的时候需要加凝胶铺板还是空板？因为有人说使用空板来爬，谢谢！~

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作者: 冰罗布    时间: 2010-3-21 22:07

谢谢，学习了

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作者: blue11sea    时间: 2010-3-23 15:55

应该使用空板来爬，因为有明胶ES也容易贴

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作者: blue11sea    时间: 2010-3-23 15:56

MEF贴壁速度和明胶关系不大吧

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作者: 可怜的孩子    时间: 2010-3-26 21:29

“对于mES细胞和MEF feeder如何分开来，我们实验室一般采用差速贴壁的方法，MEF feeder1h左右在明胶包被的皿上有70-80%贴壁，而ES细胞基本不贴。”
- A3 h5 G/ e9 z/ O' P0 z- h: S3 j4 R4 d! W8 W- \+ y3 f
丝裂霉素处理过的MEF吗？

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作者: starlight    时间: 2010-3-26 23:09

我也是采用差速贴壁的方法，沉降时间可稍微长点吧，另外也可考虑用无饲养层条件培养

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作者: zpzp0312    时间: 2010-4-1 21:04

挑取单个击落进行消化1 I: U; m% L- y) d* D7 f
单个集落的细胞数目足够满足实验需要

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作者: ssuwhite    时间: 2010-4-2 16:41

学习下

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作者: mominglily    时间: 2010-4-6 17:17

回复 12# zpzp0312 2 }7 g) m9 ^# a$ B( N4 o! `+ a

* F( n7 }* C5 e" a+ R& ?$ W3 t1 k
% D5 v8 f+ K, m/ G, c* H& E    请问怎么挑取单个集落啊？从来没试过勒，请教下！谢谢！

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作者: mominglily    时间: 2010-4-6 17:19

回复 11# starlight ( i; ]; e- O/ ^$ M- [# P

  Q" O+ x% n1 d& k嗯，也有考虑过用无饲养层培养的方法，但目前仍限于用有饲养层的培养方法。
& O$ h$ b' M1 x4 Q还有就是延长沉降时间，具体需要延长多久呢，我担心沉降久了mES细胞也会贴壁了，那样的话将会损失不少干细胞呢！

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作者: mominglily    时间: 2010-4-6 17:27

回复 10# 可怜的孩子
3 u! W1 t$ `" \1 U7 h
, Y, o# R  {( o( _  T( \, P" h5 h. E# }# [( z* r& ^+ Y
    对，是丝裂霉素处理过后的MEF，且是已经支持mES细胞生长以后的MEF，在mES传代或冻存或者用mES细胞来做MTT试验需要对mES细胞计数埋板时，想把原来支持mES生长的feeder去除掉，这样埋板时的mES细胞就会比较纯粹一点。

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作者: ssuwhite    时间: 2010-4-9 10:37

本人也是个菜鸟，但看到师兄做的可以用机械法分离。我看到的文献，是用胶原酶分离。

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作者: ssuwhite    时间: 2010-4-9 10:39

[attach]5536[/attach]

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作者: sniper    时间: 2010-4-10 15:43

我也正在做这一步实验，师兄说挑出细胞集落，消化成单个的细胞就可以用了

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作者: 上海过客    时间: 2010-4-13 08:36

小鼠的克隆团 太小 ，似乎 不如  人的 ES 那么大啊 。
# R7 `1 q! Q1 {- C8 p* r3 p/ S! S% r( V2 w2 h0 {8 q
这个也比较麻烦 ，而且每次 总感觉能挑出 一些MEF 来 。比较麻烦

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作者: mominglily    时间: 2010-4-16 16:53

回复 20# 上海过客 7 h, E2 i( E! h" n+ |

7 |  t7 V! D6 q5 m8 J8 |& l- s2 z8 ^4 h
    那么请问用什么工具来挑呢？没做过，所以很懵！谢谢指导！

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作者: 上海过客    时间: 2010-4-17 07:56

回复  上海过客 3 @. b& h, ]8 O- g1 v

" c! |: S8 |7 c, K/ l6 G$ @9 X1 T9 h
    那么请问用什么工具来挑呢？没做过，所以很懵！谢谢指导！
9 u# c+ u! V: ^5 c* b& Xmominglily 发表于 2010-4-16 16:53

2 w  s9 [/ z6 ?* K这个 用 自己拉的针 或者 200的黄枪头 都可以 。

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作者: bjchen789    时间: 2010-4-26 15:46

我知道可以采用磁珠分选的方法

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作者: get0715    时间: 2010-4-30 11:12

谢谢，学习了

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作者: zsc78    时间: 2010-5-7 21:43

可以用SSEA-1的磁珠进行分选，可挑克隆应该更加可行和方便。

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作者: ruofan1982    时间: 2010-6-7 16:41

需要明胶包被的，我们也是用的差速贴壁的方法，MEF细胞45分钟左右就基本贴壁了，再轻轻吹，即可将ES吹下，离心获得ES细胞

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作者: farmer    时间: 2010-6-8 17:32

学习了。

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作者: leestone    时间: 2010-6-8 21:11

我們差速貼壁用到兩個小時，但是取當時輕貼壁的ＥＳ，用PBS輕沖即可得到
) `; X8 H, x7 L! A* Z得到的細胞形態相當光滑亮麗/ {% h! [7 {2 |/ \% r3 N9 i
用來打囊胚效果超好

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作者: ghfvcat    时间: 2010-6-17 10:53

回复 19# sniper 5 u% L0 a9 w2 e& r! U5 x/ J
  L; y% \. s# I
是用什么消化成单个细胞的？

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作者: excellbio    时间: 2010-6-22 15:50

最近想做胚胎干细胞了，请问大家提到的胚胎干细胞饲养层，大家都用的是那个单位的？

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作者: cortex    时间: 2010-6-22 19:02

基本说的很全面了：1 差速贴壁，可取；2 无饲养层培养体系不错；3 磁珠分选也行；4 手工挑选也不错（具体方法：用巴斯德管自己拉针，在体式显微镜下对克隆进行挑选）。至于消化成单细胞，可以用胰酶消化，当然，也可以用dispase，它较之胰酶要柔和谢。自我感觉胶原酶消化的不怎么好，传代后细胞状态好像不怎么好，可能是个人原因吧。

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作者: tspaulzhao    时间: 2010-6-22 21:12

Thanks.

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作者: ghfvcat    时间: 2010-6-24 22:42

回复 31# cortex # `" ?0 ~1 ?; F& U6 T8 F3 j( ^! w
7 r& d7 L. N$ c+ j3 H
8 ^4 K/ |* r+ N- O6 @
    dispase？没有用过啊，是哪个厂家的，什么型号？

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作者: luyoude    时间: 2010-7-31 19:36

用差速贴壁发分离  是将ES克隆和饲养层消化成单个细胞然后进行贴壁 还是消化时ES克隆不要消失成单细胞 然后贴壁??  后者可以清楚的看到没有贴壁的ES克隆！但这样ES克隆中是否会含有MEF啊！！前者都消化成了单细胞 有点难易辨别ES和MEF

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作者: show0ji3    时间: 2010-8-1 09:46

我们实验室用的是减速贴壁的方法 ，40分钟到2个小时吧，看情况

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作者: 艾心痕    时间: 2011-4-7 17:59

我们实验室也是用差速贴壁的方法，我们用的是没有明胶铺板的空白皿，MEF当然是丝裂霉素处理过的。

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作者: tigerfish    时间: 2011-4-21 00:11

建议直接用Feeder Free6 @9 y. K  w5 u% h8 @
推荐STEMCELL公司的mTeSR®1或者mTeSR®2
. k+ G% I: v+ r+ @- q; M' j加上MatriGel! _7 N8 `' b- H
http://www.stemcell.com/1 A3 j  P9 [* x6 ?7 C% ?
做之前最好对比一下有Feeder和Feeder Free的生长

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作者: Helena110    时间: 2011-5-27 18:23

我自己也根据别的细胞邮差速贴壁现象就把mef和ES也试了试差速贴壁, 效果蛮不错的.

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