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标题: 关于外周血干细胞分离实验几点疑问 [打印本页]

作者: duoduo777001 时间: 2010-3-18 08:55 标题: 关于外周血干细胞分离实验几点疑问

以下是我们在做外周血干细胞分离时候步骤，但实验效果不理想，望赐教！谢谢$ B) W* d0 k/ G( E" G9 H* A; X
1、取兔血30ml，平均分装在三个试管里。
2、取3个新试管，分别加入10ml的histopaque（1007+—0.001）
3、离心，400xg 1h
4、离心后出现4层，提取出白色薄膜层。
5、像提取的薄膜中加入5ml 1xpbs! S0 ]7 k( G& I8 |& f& b
6、250xg 10min 离心3 Y9 r1 x0 U' Z' v5 N3 n7 n" O$ t
7、弃上清后加入3ml 1xpbs，离心，250xg 10min（重复2次）
8、弃上清后，加入0.5ml1xpbs吹打，转移至dish中，最后再向培养皿中加入1.5ml的DMEM培养液（10%FBS 1%p/s），再于培养箱中培养。# X0 \4 w! a* X0 r$ |" ^  e. [+ `
3 i$ r) c. S/ j: A* L3 j
问题：1、在这个实验加入hispaque之前没有加入与血液等体积的PBS溶液，请问这个溶液加与不加都可以吗？2 c! p: z( T# Z2 J3 R" X8 y- {8 ?
   2、取白膜是十分困难，每次离心后看到的白膜基本处于透明色，且非常薄，十分不易提取，有没有什么好的办法可以建议一下，或者说实验步骤上有哪里需要改进。
   3、对于第一次离心的时间上应该如何把握，与血液的量有什么样的关系，如果有，是怎么样的比例。1 Y/ b) ]) H+ H: r
谢谢赐教！

作者: yuheng 时间: 2010-3-18 09:14

没用过histopaque，但用ficoll分的时候必须要先用PBS稀释血液。; q D7 t& _" Q
白膜少极可能与离心有关，建议离心时关闭brack。ficoll方法分离时采用2300g*30min。
另外不要摇晃离心后的管子，防止破坏白膜

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