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标题: 本人准备做实验，请各位老师给我看下我的实验方案 [打印本页]

作者: chenziqiu 时间: 2010-3-18 16:19 标题: 本人准备做实验，请各位老师给我看下我的实验方案

各位老师我是一名准备做实验的临床小硕，准备做BMSCs向神经元样细胞分化的实验，看了文献后感觉很迷茫，几乎每篇文献的提取分离方法都不一样，实在不知道咋办，我看了一篇文献用下面的方法分离和纯化，想请各位老师帮我看看是否可行，或者您们能推荐一个比较好的方法（取老鼠的最好），谢谢，哦还有，最好能把方法细化一下，因为我几乎没接触过细胞培养，有劳了

1 BMSCs获取
1.1 取3月大SD大鼠，麻醉后处死，无菌操作取双侧股骨、肱骨，截断后用DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，用无菌PBS（pH 7.4）将采集的肝素抗凝骨髓1：1等体积稀释。, D8 W* w2 T/ F9 M8 k
1.2 加在密度为1.077g/cm3的淋巴细胞分离液上，1800r/min离心20min，取单个核细胞层，PBS洗2遍。在细胞沉淀中加入DMEM/F12培养皿中，在CO2培养箱中培养。
1.3 24h半量换液，以后每两三天换液1次，细胞长满80%-90%汇合时用2.5g/L胰酶（含0.2g/L乙二胺四乙酸）消化转代，1：4传于新的培养甁中，原代培养结束。传代培养细胞长满后按照1：3或1：4传代，不同代次的细胞均用a-MEM+体积分数为0.2的胎牛血清+10%二甲基亚砜冻存，在倒置显微镜下对细胞生长和形态进行动态观察，直至获得排列呈漩涡状、贴壁生长的长梭形BMSCs。
* g1 a0 n! F# b0 y F3 l
2 BMSCs鉴定5 Q$ x9 Q& k/ O" G; r# n! L! Z
2.1 生长情况及形态观察：采用倒置显微镜并通过显微摄像技术记录原代及传代培养的BMSCs生长和形态动态观察，直至获得排列呈漩涡状贴壁生长的长梭形BMSCs。) Z* C& |5 J- m) z+ R4 Y
2.2 细胞表型的鉴定：倒置显微镜下逐日观察原代及传代细胞的生长情况和形态特征，收集第二代培养的细胞，用25%戊二醛与4℃下固定过夜：按标准SABC检测试剂盒说明进行免疫化学实验，检测CD34、CD44、CD54、CD68、CD71抗原表达。

作者: helen841102 时间: 2010-3-20 18:10

我也想知道谢谢

作者: decloud2009 时间: 2010-3-24 00:42

你去找一些外国的文献，像nature 上就有protocol，应该可信度比较高，
9 \" j4 }3 g* [2 r1 p
然后像你说的最基本的细胞培养之类的，可以找学基础的同学阿，老师啊，看人家怎么做实验，，试着养几天293就会了，，，. M3 @6 v6 ~. s& z0 R

我也是边学边做的。。。。。

作者: helenkim 时间: 2010-5-5 11:22

大鼠MSC细胞标志测的有：CD29,CD90,CD34,CD44,CD45等。
其中CD45,CD34为阴性- {2 v: \8 h$ Q: Z2 w
CD29,CD90,CD44为阳性

作者: prettybear 时间: 2010-5-5 12:42

本帖最后由 prettybear 于 2010-5-5 12:43 编辑 4 {1 K5 T; ? ~; b& a! @

直接贴壁法，可以得到更多的BMSCs。

最原始的分离方法，简单，异行，不用诱导可自发向神经分化。

作者: kqyy 时间: 2010-5-5 22:56

不需要用麻药和肝素,为什么不做流式检测表明抗原呢

作者: qianqianlaile 时间: 2010-5-6 09:59

贴壁法，我们都这样做的，操作简单

作者: mbpsky 时间: 2010-5-7 21:42

我也是贴壁法...不过材料是脐血..除红细胞方法不一样吧....我们是先粗略除去大量红细胞...再精提...

作者: zsc78 时间: 2010-5-7 22:15

最简单就是直接贴壁法，nature protocol上面的方法只需要贴壁几个小时就换液继续培养就可以了。

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