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标题: 脂肪干细胞的获取 [打印本页]

作者: ww2869 时间: 2010-3-22 11:46 标题: 脂肪干细胞的获取

大鼠脂肪组织消化的具体方案：酶的浓度、消化时间、最适温度、离心转速及时间等，多谢了！

作者: 细胞海洋 时间: 2010-3-22 12:35

首先在论坛查找“脂肪干细胞”看看这方面的帖子

作者: ww2869 时间: 2010-3-26 21:35

谢谢

作者: polly 时间: 2010-3-30 13:11

取腹股沟的脂肪，去除血管及膜等杂质，再尽可能的剪碎（有利于消化），再加入0.25%的胰酶水浴消化30min（时间不是非常限定的，看脂肪消化的程度，消化成糊状即可），终止消化后离心（1200rpm,6min），洗两遍后接种！

作者: xiaogongji 时间: 2010-4-12 22:52

我是交大医学院的学生，qq:290036556，养脂肪干细胞，还是没出来，请各位高手，给予指导，非常感谢，电话：15091057632，电子邮件：jiwenchenbaoyan@163.com ，能不能说详细点

作者: ww2869 时间: 2010-5-2 11:15

多谢赐教！

作者: hanchao 时间: 2010-6-11 23:00

人来源脂肪干细胞的培养

1．脂肪干细胞原代培养
1) 取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml。
2) 吸取缓冲液PBS 7ml加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；( ]( t8 Y# a' t! c% P8 r
3) 向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%，I型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30min。此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；
4) 吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；7 t3 c( q' [* Z, N- N
5) 用吸管吸取上清后去掉，加入1ml 培养基，轻轻吹打10~20次制成细胞悬液，将各个离心管中的细胞悬液收集起来，接种待用；& d! h) S# b6 e7 R* J) T
6) 在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2-3次，将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5% CO2培养箱培养；
7) 第一次换液：大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。5 }  }2 R/ K% u9 G7 Y3 u
2. 脂肪干细胞传代培养1 v( _* ?3 Q8 O& o
1) 在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；
2) 培养箱内进行消化（3-5min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；
3) 用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；
4) 将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养；8 {" ]' n8 V3 b! z+ F$ E  D% |
5) 显微镜下逐日观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到90% 以上融合时，再进行传代，如此反复。

5 {5 C& S, g2 V- d
3. 脂肪干细胞的冻存7 C, o- r6 _3 F8 e( d* z5 r$ j
      将传代培养的细胞悬液以1×106cells/ml的比例加入预冷冻存液（含5% DMSO，30%胎牛血清的DMEM），充分混匀后置预冷的冻存管中。将冻存管置于-80°C低温冰箱中过夜后，投入液氮中保存。
4. 脂肪干细胞的复苏
1) 取出液氮中的冻存管，迅速投入37°C水浴中快速晃动，直至冻存液完全溶解，复温在1-2分钟内完成；
2) 用酒精棉球擦洗存有细胞的冻存管以减少污染；" x2 Q  ~' C. L% z2 K- v9 ]
3) 无菌条件下吸出细胞悬液至离心管中，补加4ml培养基后离心(1000r/min, 5min)，弃上清；
4) 收集细胞，用培养基吹打成细胞悬液接种在培养瓶中，于37°C, 5%CO2培养箱中培养。

作者: dc1055 时间: 2010-11-17 14:49

不错，多学习

作者: xiaodiao123 时间: 2010-11-22 14:17

xiexie

作者: luoye1986 时间: 2010-11-24 15:31

回复 7# hanchao ! g( [/ F. m; B' }2 D

9 N% ?' y& e9 Q5 d1 h
谢谢，拿走了！

作者: sijicc 时间: 2010-11-27 11:24

1 不要用胰酶，对细胞有损伤。用胶原酶ii型" V$ V$ I6 _, K0 U) O% j. g
2 胶原酶浓度是关键，0.075%即可，关键是现配现用！切记！
3 消化时间30-45分钟，脂肪的要消化两次。8 u, h+ E7 K0 j
我做过很多次脂肪干细胞，100%成功

作者: llhxq09 时间: 2010-12-1 22:32

回复 hanchao 的帖子

对我很有帮助，谢谢

作者: llhxq09 时间: 2010-12-1 22:32

对我很有帮助

作者: hanchao 时间: 2010-12-2 21:43

回复 llhxq09 的帖子/ U) ~ e, s4 U( E' P

嘿嘿，那就好，那就好~

作者: S20091415 时间: 2010-12-19 20:37

作者: zerollx 时间: 2010-12-20 18:43

回复 hanchao 的帖子' K, h7 `4 }; j" j, P4 c2 C
5 {- l; k, z' @
为什么大多数都用大鼠做，小鼠不可以么？

作者: xiaodiao123 时间: 2011-1-19 14:40

回复 luoye1986 的帖子 \8 A6 j9 w- X7 {; [, Y
3 ^5 R* [- f' {) q: h
哈哈哈哈，您老人家还挺搞笑

作者: manybit 时间: 2011-1-21 10:26

hanchao 发表于 2010-12-2 21:43 % k) R) W; v* F4 C5 b" A q) c& Z
回复 llhxq09 的帖子
; x; n& [% I! {' a+ s& |$ `/ i; C9 k- i/ P t% o, `
嘿嘿，那就好，那就好~

6 L8 @9 m g5 R$ O
这种培养方法怎么怎么是脂肪干细胞呢

作者: 雾里看花250 时间: 2011-4-12 17:26

作者: lnyxyzhangwei 时间: 2011-4-18 10:29

回复 xiaogongji 的帖子
# p0 P5 `9 l/ M5 |" l3 Y( q
对于脂肪干细胞的消化，在酶的选择上，是选择胶原酶-1型，还是选择消化作用比较强的胰酶上，可以用胰酶代替胶原酶吗？那时间怎么把握？

作者: mirrida 时间: 2012-2-17 16:57

真是解了燃眉之急啊，不过，好像在消化前将组织剪碎会更好，要不然分离的细胞太少。最好取腹股沟脂肪，收集前过一次筛。

作者: cneagle66 时间: 2012-2-17 17:18

回复 hanchao 的帖子
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请教一下，这样分离的干细胞中，是贴壁的还是悬浮的，有没有间充质干细胞在里面？

作者: yxp 时间: 2012-2-22 16:52

我们实验室的步骤是，取下小鼠的脂肪组织，放在无血清DMEM培养基中，剪碎，离心去上清，加适量0.075%的一型胶原酶（DMEM配置，0.22um滤膜过滤），置于37度水浴摇床消化一个小时（注意避免水进入而污染），取出后过40目筛网（BD），用无血清DMEM洗涤两次，最后用MSC培养基重悬（80%α-MEM+20%FBS+ps+非必须氨基酸+谷氨酰胺）铺盘，一般一只C57鼠提的细胞铺一个6cm盘

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