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标题: 请教酶切质粒电泳图的疑惑 [打印本页]

作者: 小鲁鲁 时间: 2010-3-26 19:49 标题: 请教酶切质粒电泳图的疑惑

本帖最后由小鲁鲁于 2010-3-26 19:50 编辑
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小弟最近为了验证酶切到底是瞬间完成的还是需要过夜的问题，可是电泳的结果令小弟无法解释。2 }% q8 K! ^9 ^, K3 [! N
从左到右是酶切时间增加，可以看到出现了4条带，最前面的是线性化的。因为最后全部是最前面的条带了。但是线性化的质粒怎么会跑在最前面呢？怎么会出现四条带呢？正常的应该是超螺旋，线性化和开环三种吧！ M* H x5 l1 e) n# [0 i
小弟用的是EcoR-1酶切PUC质粒。
谢谢各位的指教，请大家不吝赐教！

图片附件: [电泳图] 无标题.png (2010-3-26 19:45, 42.94 KB) / 下载次数 203
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTIwMnwwNjc3ZDkyM3wxNzcyODkxMjAyfDA%3D

作者: ambassador 时间: 2010-3-26 22:16

我看你这个图好像是酶切失败了吧！更像是质粒不纯的图。
我的分析：前期有各种混杂片段，跑的速度各不相同，其中就有酶切片段，最后跑时间太长了，就一起跑出了胶外，这就是最后泳道所示。# C. K# q5 @- D/ i$ |, L
EcoR-1酶切PUC质粒，应该有两个位点，按道理是只有两条带。
所以对于你所说4条带不太明白（你的质粒上有几个酶切位点？）2 O4 _" i8 ?' E
欢迎交流！

作者: 小鲁鲁 时间: 2010-3-27 10:57

谢谢楼上赐教。
是只有两个酶切位点。但是第一泳道的图不能说明质粒不纯，四条带很清晰；而且也没有跑出泳道的问题，看第五泳道的条带亮度应该可以判断。- C! n4 m* W. S2 D! b9 a2 Y7 |6 @( Z
我很疑惑的问题就是这四个条带是怎么来的。被酶切后的质粒就会形成线性化。
欢迎继续讨论。谢谢！

作者: janeyu 时间: 2010-3-29 16:19

我觉得首先检验下你的质粒是否有问题，可以做个测序看看序列和质粒图谱上的序列是否一致，再确定下这个质粒是否真的只有2个酶切位点，或者质粒上的其他酶切位点和这两个酶是否存在同裂酶什么的。一般酶切的效率最高的阶段是在前2小时，可以适当延长酶切时间，我觉得过夜与酶切6h没什么区别。

作者: 小鲁鲁 时间: 2010-3-29 17:16

谢谢指教，我也只是自己检测一下，做个小实验检验。没有深究。谢谢支持！

作者: 不倒翁 时间: 2010-3-29 17:49

电泳的条带怎么那个样子啊，不正常吧

作者: 小鲁鲁 时间: 2010-4-2 16:09

是感觉有些问题，但是不好解释到底是什么问题。欢迎继续赐教！

作者: rainsky1314 时间: 2010-4-7 16:31

EcoR-1酶切效率很高，一般都不用过夜切的，而且酶的酶切效率在前３小时最高，再往后会由于酶失活而效率降低；再说你这张电泳图，真的很奇怪，不懂！不知道你用的是多大浓度的胶？

作者: cony 时间: 2010-4-12 10:42

学习了。

作者: manyuping 时间: 2010-4-13 20:42

我来试着回答- A! L8 v7 s3 e5 G, a2 V1 A
第五涌道应该是完全酶切的图，只有一条带说明这两个酶切位点的位置可能刚好能够将该质粒切成两条大小相等的条带。如果是这样的话，未完全酶切时出现四条带也是有可能的，按分子量从大到小的顺序应该是：开环-只切开了一个切口的线性分子-超螺旋结构-两个酶切位点处均被切开所形成的线性分子。

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