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标题: 脐带间充质干细胞的具体培养步骤 [打印本页]

作者: wojoo 时间: 2010-4-12 21:16 标题: 脐带间充质干细胞的具体培养步骤

转帖看到的一个好贴子原创ye_xiangyang' P( @5 h% g" [/ S

我说说吧，主要有组织块贴壁法、双酶消化法，两种方法中我建议要是不急的话选用前一种方法，因为，操作相对简单，只是时间要长点，一般要15-20天传第一代。不管用什么方法，脐带来源无菌十分重要，操作时也要注意不要污染。/ W" \- F; V. h: Z5 o0 s
组织块贴壁法：PBS反复冲洗脐带，特别是在脐静脉内的血液用注射器冲洗。在培养皿内顶住脐带，先用大剪刀剪成大碎块，再用眼科剪刀细细的剪成1x1mm大小的组织块，剪碎过程中不要加入PBS，这样容易点。剪碎以后均匀铺开组织块，间隔1cm即可，倒置培养皿，放入37°培养箱，一个到一个半小时取出，见组织块已经粘附在培养皿底部，延边源缓缓加入培养基，一定不要冲起组织块，要让培养基逐渐蔓延整个培养体系，再多加点，放入培养箱内，不要动，一周后上镜看，如果有细胞沿组织块边缘出现你就赢了，可以以后间隔3天换液了，等到组织块周围细胞呈集落生长，可以传代了。" i1 u9 g) S4 l3 P, D
浅见，我培养过。挺成熟的技术，望成功。

作者: 157238360jwj 时间: 2010-4-17 23:38

我用的是酶消化法，但是在脐带分离的时候，一定要在无菌环境中，脐带取回来，先用无菌生理盐水冲洗，可在生理盐水中加一些青链霉素，冲洗过后去除脐带中的血管后，可将脐带剪成3-5cm大小，再在上面剪些小眼增加消化面积。加酶消化（胶原酶+透明质酸酶）于培养箱消化20小时。一天后观察是否污染，其后3天换液。等细胞贴壁生长，那样就可传代了！

作者: 烂桃 时间: 2010-4-21 14:58

我做的是猪的UCMSC，用的是组织块贴壁法，剪碎前也剔除血管，但是发现养出来的还是有很多杂细胞，而且杂细胞长的速度比MSC快，看文章有的说脐带外面一层羊膜也剥掉，我试了但是没成功，现在我主要是通过传代使其纯化。消化法我也试过，但是得到的细胞生长速度极其缓慢，我不知道是什么原因，希望楼主给些指导，是不是猪的和人的UCMSC有些区别。我查资料说人的期待有三根血管，但是猪的脐带分离出了四根管子，不同物种的脐带结构还有区别吗

作者: 5784630 时间: 2010-4-24 21:40

楼主，我想请教你，你在将组织培养过程中大概什么时候才将组织残渣移去？

作者: viva 时间: 2010-5-1 17:20

xuexi

作者: charlesman 时间: 2010-5-4 11:42

呵呵学习了

作者: zhangmingqi111 时间: 2010-5-18 19:56

好资料

作者: helen841102 时间: 2010-5-19 15:53

xieixe

作者: 清影 时间: 2010-11-5 15:34

请问2楼，透明质酸酶是什么作用啊，去除粘稠么？

作者: xuzhili 时间: 2010-11-5 17:39

经典的做法

作者: xuehu20 时间: 2010-11-9 14:28

有见地

作者: zhangyujunwei 时间: 2011-4-8 22:57

回复 wojoo 的帖子$ K, W% g- U, z5 | a c' ]

很好的办法

作者: taoqilh 时间: 2011-4-11 10:48

回复烂桃的帖子) }2 ~, o3 D3 L2 L% ]3 ^" |9 b
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我也是做猪的脐带间充质干细胞，我做的过程中只有三根管，没有出现四根的，在培养过程中遇到了和你一样的问题。我尝试了消化后的细胞培养，由于先贴壁的以杂细胞比较多，所以在三天后把培养瓶里的培养液转移到另一个瓶子里，转移后贴壁的细胞相对而言纯一点，传代后基本看不到什么杂细胞

作者: taoqilh 时间: 2011-4-11 10:51

回复烂桃的帖子7 ~+ I8 z- h5 |7 [# m+ F# T
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你好，能加你为好友吗，我也是做猪的脐带间充质干细胞的，能和你请教一些问题，分享的点文献吗，关于猪的脐带间充质的文章还是比较少，借鉴的东西也少，和你请教一下。我是新手，没有加你为好友的权限，能加我为好友吗

，谢谢

作者: Learner 时间: 2011-4-12 10:19

我前面两种方法都试过了，但是都不太成功。第一次，我用酶消化法因为样品取来较晚，用的是四型胶原酶过夜消化，第二天早上想离心发现消化后的样品太粘稠了，即使离心也有很多细胞在上清液中。我就直接将上清和下面的组织块分别种在培养皿中。三天后发现细胞大量死亡，我还以为是污染了，其实不是。我将它们全部换液，看见皿底有少量细胞贴壁，星星点点。换几次液后细胞都活下来了。但是很少，长的也不快，看来要很久才能长满。: ?: o: N0 W6 I
第二次，我用了消化法和直接贴壁法两种。消化法没有过夜，按照一个文献中讲到用0.1%胶原酶消化一小时，再用0.25%胰酶消化半小时离心。这次有了上次的经验，我用体积远远大于消化液的PBS稀释后离心。种到培养皿中结果第二天细胞大部分都死了。是不是过度消化了？
直接贴壁法：我剔除血管后，将组织剪碎然后再将剪碎后的组织贴于培养皿底部，中间没有留出间隔。在超净台中放置15分钟使组织贴壁后缓慢加培养基。第二天观察组织周围有一些圆形未贴壁的细胞。三天后换液，还是不见贴壁细胞，那些圆形细胞很小也不知是死是活。看起来也不乐观。可能是我性急，总想看，即使不看，在细胞爬出来之前用不用换液？希望做成功的前辈不啬赐教！

作者: Learner 时间: 2011-4-12 10:25

回复清影的帖子' n( v" F+ W: P I, C- T7 p. } q
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有文献说：脐带wharton Jelly中主要是透明质酸。

作者: Learner 时间: 2011-4-12 10:30

两篇文献关于脐带间充质干细胞的分离方法和大家分享一下！

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