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标题: 小鼠BMSC原代培养经验交流贴~~ [打印本页]

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-20 23:13 标题: 小鼠BMSC原代培养经验交流贴~~

本人原代操作步骤为：1、处死小鼠，75%酒精泡5~10min，并准备3个盛有培养基的皿。7 o- ?- K3 A3 ~. b
2、先初步分离小鼠的股骨、胫骨和肱骨，放入第一个皿中。
3、仔细出去骨头上的肌肉和筋膜，放入第2个min% T2 K+ N5 c u: ~ b a
4、减去骨的2端，用1ml注射器吸取培养基吹出细胞，只到细胞泛白。
5、收集第三个皿中的细胞悬液，800g 5min，去上清
6、制备单细胞悬液，接种到一个皿中。
今晚刚做到这里，不知道明天结果如何，以上步骤如有不足的地方欢迎大家指出。
此外，个人觉得仔细分离骨头上的肌肉时，将其放入75%的酒精中泡几秒会比较容易剥离，但至于是否会影响到里面的BMSC还不知道。

作者: china1983chen 时间: 2010-4-20 23:47

学习了，谢谢楼主

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-20 23:49

欢迎大家来讨论~~本人也是第一次做原代培养~~

作者: tanhehe1006 时间: 2010-4-20 23:51

有可能有很多造血干细胞的污染的。小鼠骨髓MSC的培养其实和人与大鼠的还是有区别的/ H2 B8 Y, J0 x8 T- \. ~& Q8 z4 O
你可以参考下面两个文章，都是来自Nature protocol的' p2 a: K0 J' D2 c( a4 u6 C# Y
[attach]6189[/attach][attach]6190[/attach]

作者: china1983chen 时间: 2010-4-20 23:52

我昨天也是第一次做，可是出来的细胞都是圆圆的，不知道是什么细胞

作者: china1983chen 时间: 2010-4-20 23:56

回复 4# tanhehe1006
" }( [, v) n' g* ^

非常感谢，谢谢

作者: tanhehe1006 时间: 2010-4-20 23:58

附上我养出来的小鼠MSC图片吧

作者: bypw 时间: 2010-4-21 00:04

看了楼主的东西和步骤，我觉得大部分是一个常规的操作，但是有机电可能存在问题：

1  取材上好像很少去肱骨吧，就是前肢，是不是这样效果很好啊4 Z. y% e+ B1 {8 T2 m
8 j9 g8 r* m' M3 }: P$ }1 O
2  减去两端，我觉得存在问题，因为干细胞主要存在干骺端，去掉后干细胞将会很少，建议直接穿刺冲。% r9 q! z7 h# I: d' ?% p1 m
3  冲出后要轻轻吹打，让细胞混匀，注意轻
4  不要用酒精泡啊，

作者: jisuyun 时间: 2010-4-21 00:10

MSC是梭性的，你的图片多角形的应该是成纤维细胞哦

作者: china1983chen 时间: 2010-4-21 00:21

回复 7# tanhehe1006 # ~6 D& x# C" x5 a
, B1 y8 O8 k( o0 z, ` p J

这是原代细胞吗

作者: tanhehe1006 时间: 2010-4-21 00:26

回复 10# china1983chen / [3 i, p. w) } V& K
! G, B7 c2 u8 n9 ~, P

是原代，是p1的照片

作者: tanhehe1006 时间: 2010-4-21 00:28

回复 9# jisuyun

" m* Y$ t& \, k+ X& l# \6 I+ t
你提的这个问题很好，但是形态是不能说明问题的对吧。我完全复制我上边发的一片用骨片养的方法，你看看这篇文章吧

作者: china1983chen 时间: 2010-4-21 00:31

本帖最后由 china1983chen 于 2010-4-21 00:32 编辑
% B6 e' m+ R' Y
回复 9# jisuyun
8 o9 U# a: b: b7 M1 z+ J
' z( U* U C2 `7 t5 U4 f8 ?" B8 z
这个就是MSC把，成纤维细胞不是这个样子的

作者: 烂桃 时间: 2010-4-21 08:36

回复 7# tanhehe1006 / X- s) c9 a: b* L, m

这是原代吗，好像不是很有活力

作者: 烂桃 时间: 2010-4-21 08:42

回复 1# angel-sakura
/ y8 v: O8 L0 f0 ]4 j
M) v4 ?( k9 E4 s, {" K* B
一般取股骨吧，在细胞室外剔除肌肉，泡酒精几分钟，剪断两段冲出骨髓，可以离心也可以不离心，我做的一般是离心后重悬接种，培养液用α-MEM或DMEM\F-12都可以，我个人感觉DMEM\F-12好一些，原代可以用15%FBS，传代10%就可以了，我一直在做不同动物的BMSC，形态都不错

作者: jisuyun 时间: 2010-4-21 10:51

回复 12# tanhehe1006

我是新手，刚做实验。昨晚下了你那两篇文章，刚才看了一下中国的那篇密质骨培养的方法，也想尝试一下。不过胶原酶还没买。我的血清也是GIBCO南美血清，并不是他说的专用于MSC培养的血清，培养基是L-DMEM。你用的血清、培养基是什么？& P3 A \9 ~/ J2 ~: v
问个问题：37度孵箱200rpm摇2h是怎么弄的？是摇床吗？200rpm怎么定的？

作者: jisuyun 时间: 2010-4-21 10:55

tanhehe1006 版主你qq多少？我们交流一下。

作者: kqyy 时间: 2010-4-21 12:41

1mL注射器太小,伤细胞

作者: jisuyun 时间: 2010-4-21 15:29

如果按那个IRAN人写的protocol，8h就换1.5ml液，一直到72h，会不会因为老是去动它而不好？有没有人用这个方法养的？

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-21 21:55

回复 18# kqyy
请问你是用多大的注射器？小鼠的骨头很小，我觉得1ml注射器能刚好冲骨髓，不知道大的注射器能不能冲？

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-21 21:56

回复 15# 烂桃
去除肌肉后再泡酒精，那酒精会不会进入到骨髓腔里面啊？那样不会对骨髓细胞造成损伤吗？此外，你分离的过程中有没有溶解红细胞这个步骤？

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-21 21:58

回复 5# china1983chen
是漂浮的吧？你之前有没有溶解红细胞？我看有的文献上说要溶解红细胞，但不知道其他人是否有这样做过~

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-21 22:00

回复 8# bypw
取肱骨是为了确保BMSC数量足够，毕竟是小鼠的~~没什么其他特别的原因，此外，我本来是准备直接穿刺冲的，但发现插不穿........所以就剪了，而且小鼠的骨头很细的，真不好弄，不知道你是怎么穿的？

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-21 22:02

回复 17# jisuyun 8 c; U% d; K! X6 \3 E
同求QQ号~~

作者: 烂桃 时间: 2010-4-22 08:17

本帖最后由烂桃于 2010-4-22 08:19 编辑 , ] [+ ~) `4 S( Q. v1 [0 {; V/ F4 c
/ S$ h% T- ]; e! u5 u
回复 21# angel-sakura " ?( z, ^' w9 H o* C* [
0 O5 [* N: M8 P! W7 i7 O

我没有溶解红细胞，我感觉有一些血细胞可能有利于原代细胞后贴壁，三天后换去大半液，可以轻轻摇晃把沉积的血细胞大部分吸弃，再两三天全换液，这时如果血细胞沉积多的话可以用PBS洗一次。分离股骨时注意两段不要剪断，泡酒精没问题，注意冲出骨髓时要先把骨上的酒精晾干，如果直接连带肌肉泡的话，会泡不透，很容易污染

作者: tanhehe1006 时间: 2010-4-22 22:55

回复 17# jisuyun 9 V( t8 g$ b3 N! k$ I2 w2 F
( _1 C$ L ]) t% j

119239794
其实我是最近才专投养小鼠MSCs的，希望能相互切磋

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-22 22:56

回复 4# tanhehe1006 4 W, t: }# B; C
请问你试过骨片培养法吗？这种培养方法怎么排除成骨细胞的污染？

作者: tanhehe1006 时间: 2010-4-22 23:16

回复 27# angel-sakura

# m2 Y. i! z2 Y5 A7 W4 s3 I
好问题，在多次传代中就消失了，况且骨片养的也提到p3-p8代研究么。重要的是在用胶原酶消化的那一步，骨片最好成一股粘絮状态，据我导师指点这样是MSC被消化下来和成骨细胞尚未很多被消化的临界状态。

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-23 00:15

回复 28# tanhehe1006
那你胶原酶消化的时间和浓度是多少？此外，你测了流失吗？

作者: tanhehe1006 时间: 2010-4-23 00:21

回复 29# angel-sakura 8 i' V! m- q4 h/ J- H( S

今天（昨天）我还做了。但是这回没有消化好，一般采取的浓度0.1%就可以了，时间我平常都是1.33-1.5个小时，我用的37℃摇床摇的。流式还没测，因为最近开始没多久，准备用消化的方法和多次传代的方法粗纯化后先反转录，流式正在预定中……那是必须做的，不知您做过流式没以及选用的标志物是什么？

作者: tanhehe1006 时间: 2010-4-23 00:31

回复 16# jisuyun ' n, Q' d, F$ t- e5 Q) Q1 e0 O
" j; i0 A- H& J! T6 C8 l& N
我用的是α-MEM，Hyclone的胎牛血清。消化就是用摇床，不过是可以调温和调速的

作者: angel-sakura 时间: 2010-4-23 18:48

回复 30# tanhehe1006 ' M; B6 D* A9 Z+ J8 k- `
我本人没做过，但我学姐做的时候是选的CD44和CD45,还有一个不记得了，不过这些论坛上好像有，你搜搜看。你养的BMSC状态怎么样？我听我导师说骨片法的话BMSC可能状态不会长得很好，因为刚从体内分离出单一的BMSC，环境变化很大，且与其他细胞之间的相互作用突然消失了，推测BMSC可能会过早老化，或者影响到其分化的能力。不知道你们有没有考虑到这个niche的变化。

作者: 碧海蓝天 时间: 2010-4-23 23:20

我觉得分离出来的股骨胫骨等没有必要用酒精泡，操作时注意无菌就行了，用两套手术器械就可以。前面的细胞图片挺漂亮，相机不错。要不就是成像系统照出来的或是Olumpus的单反机相相照的，细胞增殖到一定程度就是梭形的了，排列整齐。干细胞总的来说还是比较好培养的。就是传代时胰酶消化不要太过，保证细胞活力为上。

作者: jisuyun 时间: 2010-4-24 13:37

我们的摇床怎么只有转速，不能恒温。
放在室内二十多度可以吗？
我上次的那个圆圆的细胞渐渐飘起来很多，梭形的细胞越来越多了，很开心。
如果可以，晚上放图片。

作者: missyoudad 时间: 2010-4-26 00:43

学习了。

作者: Jocelyn 时间: 2010-4-28 10:00

回复 7# tanhehe1006

  d) }7 z" u& F7 Y, n4 w: W$ b- L) D* R
   你的BMSCs细胞长的很诡异啊~~形态不对吧???
   你分盘时的密度低了吧~??1比几传代的??5 ]2 [0 S' s. L# v! p
   细胞第几代了??

作者: 红色贝鱼 时间: 2012-4-7 22:20

恩，我要第一次养原代，来参考一下

作者: baiyumeng 时间: 2012-5-8 09:19

学习下

作者: lipenix 时间: 2012-9-17 22:23

这个很好，学习了！

作者: _然然 时间: 2012-9-18 10:53

回复 angel-sakura 的帖子" D' d) Q+ G) Q) @

请问取股骨胫骨后是不是需要把肌肉去的很干净还是只要两端没有就可以呀？

作者: 细胞海洋 时间: 2012-9-19 00:05

回复 _然然的帖子3 A' v# n$ o9 t
; @) ^1 @9 B6 c' b, t0 m
建议你发新帖提问

作者: jensn 时间: 2012-9-27 14:10

看了楼主的操作步骤，把我们实验室的步骤拿出来分享下：9 E6 i( m9 j8 r, R. F' B
1、脱颈处死小鼠（或者用乙醚麻麻醉过量的方法），用75%酒精将老鼠全身浸湿消毒，放在试验台上。嗯，试验台也算我们自己的原创吧，因为小鼠比较小，定制的试验台不合适，我们就用泡沫盒的盖子酒精消毒后再铺上一次性的PE手套使用，同时为了方便固定小鼠的四肢，我们用1ml注射器针头将小鼠四肢固定在泡沫板上就很方便操作了。8 m4 K2 t7 X( E: l
2、用镊子提起小鼠腹部皮肤，沿小鼠腹股沟剪开，初步分离出小鼠的股骨和胫骨，放入盛有PBS或者生理盐水的培养皿中。因为这时骨头上连有肌肉筋膜等附着物，而且骨髓腔也没有暴露出来，没必要用培养基来泡着，有点浪费。3 a( M& H  P" H# p
3、小心用小剪刀以及手术刀片剔除骨头上的肌肉和筋膜，用小号的止血钳双手夹住股骨和胫骨交合两端，沿交合膝盖骨相反的方向轻柔折断，这时会暴露出股骨、胫骨完整但无附着物的交合端口，用镊子夹住端口，可以很容易将干净的股骨、胫骨分离出来。$ J0 `8 m3 n% a) |0 ?- j- x
4、一只老鼠，我们可以得到四根骨头（两根胫骨、两根股骨），这时，还是把分离出来的股骨、胫骨泡在另一个干净的、含有PBS或者生理盐水的培养皿中。* p  f3 m2 L- q6 @# w5 C
5、用5ml的注射器装满培养基（因为要冲骨髓腔了），接上头皮针。用头皮针刺入股骨、胫骨交合端口，由于股骨、胫骨交合处自然的构造，头皮针也很容易刺入。这是需要注意的一点是，小鼠的骨髓很小，刺入不能用力太猛，不然直接就把整个骨髓腔刺穿了。剪去股骨、胫骨的另一端，推注射器，将骨髓腔里的细胞冲出来，只到骨髓泛白，这是承接培养基和细胞混合液就改成15ml的离心管了。( `, K3 k" K( z8 I4 I
6、将4根骨头都冲洗干净后，500g 离心10min，倒弃上清，加入10ml培养基（含10%FBS，1%双抗、1%L-glutamine)重悬细胞，分为两个25T的培养瓶。
7、置于37°，5%CO2培养箱中培养。
8、第四天，半量换液。  V# j) y+ ^" a! X1 N' }2 e0 }8 |! `
9、第10-12天第一次传代细胞。! O/ C  h7 U/ E. a
、

作者: 笑笑123 时间: 2012-10-9 16:07

感觉像神经细胞啊。。。。

作者: pear7127 时间: 2012-10-14 10:16

哇，最近正在为这个实验发愁啊，谢谢楼主~~

作者: nicholas_cyy 时间: 2012-11-13 03:02

回复 jensn 的帖子& H+ {1 s$ d1 w' `. _' m

你好，请问第一次换液后几天再次换液？

作者: nicholas_cyy 时间: 2012-11-13 03:42

回复烂桃的帖子
- [" _8 x* Y. d) Q
您好，我也是这样换液，可是结果就像我发的图片一样，求指点！

作者: jensn 时间: 2012-11-13 09:06

根据细胞生长情况，每3-4天换液

作者: 644414915 时间: 2013-1-8 13:53

回复 tanhehe1006 的帖子0 q" H' @, r# T1 A+ n* F
# K/ `$ B# m* X9 M! `) J% F
这两篇文章我都做过，一直没做出来。骨片法老是污染。没有一次逃过污染的。

作者: 644414915 时间: 2013-1-8 13:54

难道是我太笨了，养了好几个月了

作者: 644414915 时间: 2013-1-8 13:55

回复 tanhehe1006 的帖子% a1 `9 e# m5 V8 K! w/ T) y

你好，现在还在养小鼠msc吗 y1 _ o; m9 j. c

作者: 沁蓝之城 时间: 2013-4-7 12:52

你好，请问楼主现在还在养MSC吗？

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