干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 关于骨髓间充质干细胞的疑问 [打印本页]

作者: 孙小牧 时间: 2018-9-20 12:03 标题: 关于骨髓间充质干细胞的疑问

刚开始做细胞实验，按照丁香园里原代细胞的protocol操作的。* d9 u8 P; s3 i! u6 Z( p7 b4 |
目前做了三次，每次都是完全培养液冲出骨髓，加到2倍体积分离液中离心之后，只分两层，没有像文献里说的那样分四层。! Q. l6 |* } d4 T, g0 s
想请教一下各位前辈，可能的原因是什么？% A% B9 }) W" a( L' [
分离股骨胫骨，完全培养液冲骨髓的操作应该没有问题。分离液是GE 17-0891-09的percoll细胞分离液。每次都是两倍体积分离液在下，缓慢加入冲过骨髓的培养液。

作者: iytbxxg 时间: 2018-10-11 10:10

白细胞层本来就是很少，别把这一层忽略了。

作者: 孙小牧 时间: 2018-10-15 12:25

回复 iytbxxg 的帖子4 h/ u" N4 y3 A, m$ e+ h y: e

做了三次都看不到白膜层，不知道是不是自己冲出来的骨髓太少，还是别的什么原因

作者: 卓俊文 时间: 2018-10-17 15:14

骨髓量少，试试1:1

作者: 孙小牧 时间: 2018-10-23 16:04

回复卓俊文的帖子
; k3 h5 |( J( l
谢谢指点

作者: cmw930922 时间: 2019-1-13 14:16

我个人觉得全骨髓法很实用，而且我不离心，直接把骨髓悬液冲到培养瓶中，效果很好。以下是我的方案
原代培养步骤
1. 小鼠（3周龄）在水合氯醛下麻醉后处死，取双侧股骨、胫骨（保证骨头两端完好，去净肌肉组织），将完整的股骨放入含1%双抗的PBS中，将装有骨头的50ml离心管（一管30ml能装4、5根）放在泡沫箱（有冰袋）运输。
2.消台20分钟，准备T25培养瓶，60mm培养皿，原代器械盒（外科手术剪，镊子，血管钳，15ml注射器）3 G8 i+ N3 H+ M, T% p
3. 先将股骨浸泡在75%酒精3min，取出后PBS冲洗3遍（完全去除酒精），血管钳夹持股骨，手术剪剪去股骨两端骨骺，用5ml注射器抽取全培穿刺冲洗（一根骨头一只注射器），直接冲入tT25培养瓶（2ml培养基）（DMEM/F12+10%胎牛血清+1%双抗）。
4. 48h后全量换液（期间不要剧烈摇晃培养瓶）

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)