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标题: 转贴：造血干细胞衰老的研究方法及其意义 [打印本页]

作者: 岱宗飞雪 时间: 2009-1-19 23:22 标题: 转贴：造血干细胞衰老的研究方法及其意义

周玥1，2，王亚平24 E& S5 Z$ R4 B' r
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1大理学院组织胚胎学教研室，云南省大理市 671000；2重庆医科大学组织胚胎学教研室，重庆市+ Y- `0 {4 s$ M" R4 Z
400016

周玥★，女，1980年生，云南省大理市人，白族，重庆医科大学在读硕士，助教，主要从事造血干细胞生物学研究。
zhouyue_120@sina.com

通讯作者:王亚平，硕士，教授，博士生导师，重庆医科大学组织胚胎学教研室，重庆市 400016# |; j) O9 {3 V' p! K- z
ypwang@public. cta.cq.cn0 g( E6 o0 v6 d% i/ e, m- r. }8 k! I

中图分类号: R394.2/ `7 ], n3 B* }  z- C5 l
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00527-04

收稿日期: 2007-09-26
修回日期：2007-11-08
(07-50-9-5287/GW Q)& i' z9 ~" X* E+ U. A4 ~1 ]* G  m

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Research methods of hematopoietic stem cell aging and its significance4 r# K- ?" i# p/ ^1 n
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Ａｂｓｔｒａｃｔ
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ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ:The quantity and quality of hematopoietic stem cells reduced during body aging. Studies on hematopoietic stem cell aging mainly included the establishment of hematopoietic stem cell aging models and the mechanism of aging.
ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ:To review the research methods of hematopoietic stem cell aging and its significance，and provide evidences for the study of delaying hematopoietic stem cell aging.1 |' J9 m3 d& `
ＲＥＴＲＩＥＶＥＳＴＲＡＴＥＧＹ

ubMed was undertaken to identify relevant articles on hematopoietic stem cell aging published from January 2000 to October 2007 with the key words of "hematopoietic stem cell aging" in English. At the same time，Vip database was undertaken to identify the relevant articles published between January 2000 and October 2007 with the key words of"hematopoietic stem cells, aging" in Chinese, and looked up the books related the empirical study of stem cells. The data were selected primarily, and then the full-texts were looked up. Inclusive criteria: ①studies about the detection methods of the cell aging mechanism, and ②articles related to the mechanism of hematopoietic stem cell aging. Exclusive criteria: the articles with repetitive research were excluded.Totally 62 relevant articles were selected and 30 of them met the inclusive criteria.The 32 excluded articles were of old or repetitive content.
ＬＩＴＥＲＡＴＵＲＥＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ:Of the 30 inclusive articles, 12 were on application of hematopoietic stem cells and its senescence mechanism, 16 were about application of the research methods of hematopoietic stem cell aging and its significance, and 2 were about the problems and prospect.% C/ z1 `# q8 {
ＤＡＴＡＳＹＮＴＨＥＳＩＳ:Aging is inevitable natural regularity of organism. Hematopoietic stem cells reduced in quantity and quality in aging. The cell aging models can be established through the hematopoietic stem cell serial transplantation, self-renewal and multi-directional differentiation ability detection, cell cycle analyses and β-galactosidase determination. The alter of aging-related telomere, protein and gene expression can be detected by Southern blot, Western blot, reverse transcription-polymerase chain reaction and microarray analysis to study the mechanism of hematopoietic stem cell aging and the path of delaying its aging.
ＣＯＮＣＬBＵＳＩＯＮ:It is impossible to avoid the aging, but we can delay the aging. It is of significance to study the mechanism of hematopoietic stem cell aging so as to deeply analyze hematopoietic stem cells and aging biology, and to provide the theoretic basis for the studies on delaying hematopoietic stem cell aging. + A. G6 @3 t) [
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Zhou Y, Wang YP.Research methods of hematopoietic stem cell aging and its significance.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):527-530(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-527(ps).pdf]

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摘要
学术背景：机体衰老过程中造血干细胞的数量和质量是逐渐降低的。造血干细胞衰老实验研究主要包括造血干细胞衰老模型的建立和衰老机制的探讨。9 I2 r( e9 |0 G  M* o( H
目的：概述造血干细胞衰老的研究方法及其意义，为延缓造血干细胞衰老提供参考。9 q' q/ z& Z+ Z8 f2 c
检索策略：应用计算机检索PubMed数据库2000-01/2007-10期间有关造血干细胞衰老的文章，检索词“Hematopoietic stem cell aging”，限定文章语言种类为English。同时计算机检索维普数据库2000-01/2007-10期间相关文章，检索词“造血干细胞、衰老”，限定文章语言种类为中文。并查阅与干细胞实验研究有关的书籍。对资料进行初审，选取符合要求的有关文章查找全文。纳入标准：① 有关细胞衰老机制检测的研究。②造血干细胞衰老机制的相关性研究。排除标准：重复性研究类文章。共收集到62篇相关文献，30篇文献符合纳入标准，排除的32篇为内容陈旧或重复文献。
文献评价：符合纳入标准的30篇文献中，12篇涉及造血干细胞与衰老机制研究，16篇涉及造血干细胞衰老常用的实验研究方法及其意义，2篇涉及存在的问题与展望。
资料综合：衰老是生物体不可避免的自然规律。衰老过程中造血干细胞经历了数量和质量上的衰竭，可以通过造血干细胞连续性移植、自我更新和多向分化能力检测，细胞周期分析、β-半乳糖苷酶测定建立细胞衰老模型，并运用Southern Blot、Western Blot、反转录－聚合酶链反应 (RT-PCR)、基因芯片等方法检测与衰老相关的端粒、蛋白及基因表达的改变来研究造血干细胞衰老的机制及延缓造血干细胞衰老的途径。  {# ~4 i7 h& N7 X1 t# C6 n
结论：虽然衰老是无法抗拒的,但延缓衰老却是可能的，因此对造血干细胞衰老机制的研究将助于更深入阐述造血干细胞和衰老的生物学，并为延缓造血干细胞衰老的研究打下坚实的理论基础。
关键词：衰老；造血干细胞；研究方法

周玥，王亚平.造血干细胞衰老的研究方法及其意义[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):527-530
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-527(ps).pdf]2 a/ A( {( U, v

0 学术背景

衰老是生物体的细胞、组织与器官在结构和功能上表现出的不可逆转地、全面地、逐渐地退化。现有证据表明[1]，尽管在机体衰老过程中造血系统的基本成分得以维持，但造血干细胞的数量和质量是逐渐降低的。造血干细胞连续性移植是最常用的研究造血干细胞衰老的体内模型，移植后通过造血干细胞自我更新

和多向分化能力检测，细胞周期分析，β-半乳糖苷酶染色等可测定衰老造血干细胞数量和质量的变化，并运用Southern Blot、Western Blot、 RT-PCR、基因芯片等方法检测造血干细胞的衰老相关端粒、蛋白及基因表达的改变。
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1 目的
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机体衰老过程中造血干细胞的数量和质量是逐渐降低的，关于造血干细胞衰老实验研究主要包括造血干细胞衰老模型的建立和衰老机制的探讨。本文就造血干细胞衰老的研究方法及其意义做一综述，为延缓造血干细胞衰老的研究提供参考。9 z  S1 _0 G7 T4 D; N

2 材料和方法

2.1 资料检索应用计算机检索PubMed数据库2000-01/2007-10期间有关造血干细胞衰老的文章，检索词“Hematopoietic stem cell aging”，限定文章语言种类为English。同时计算机检索维普数据库2000-01/2007-10期间相关文章，检索词“造血干细胞、衰老”，限定文章语言种类为中文。并查阅与干细胞实验研究有关的书籍。对资料进行初审，选取符合要求的有关文章查找全文。纳入标准：① 有关细胞衰老机制检测的研究。②造血干细胞衰老机制的相关性研究。排除标准：重复性研究类文章。共收集到62篇相关文献，30篇文献符合纳入标准，排除的32篇为内容陈旧或重复文献。
2.2 检索方法符合纳入标准的30篇文献中，12篇涉及造血干细胞与衰老的机制研究[1-12]，16篇涉及造血干细胞衰老常用的实验研究方法及其意义[13-28]，2篇涉及存在的问题与展望[29-30]。
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3 综合评价

3.1 造血干细胞与衰老机体组织内环境稳态间接由组织特殊干细胞控制，这种干细胞产生组织器官中的各种分化细胞，但这些分化细胞的寿命是有限的或是在生理活动中逐渐的消耗，干细胞必须在有机体生命过程中发挥功能不断补充损耗的细胞，以保持内环境的稳态，并避免组织的衰退和发育不全。现代研究表明：衰老组织保持稳态能力下降，或在应激或损伤状态下恢复稳态能力下降，其关键原因是衰老过程中干细胞的衰退。就造血系统而言，渐进的衰老表现为造血细胞的产生及造血微环境稳态调控能力的下降[1-2]。
造血干细胞是血液谱系中最重要的细胞，具有高度的自我更新、多向分化、跨系分化与重建长期造血的潜能,其作为一种组织特异性干细胞，通过不对称分裂一方面维持自身数量的相对稳定，另一方面生成多系或/和单系造血祖细胞，以维持机体的正常造血功能[3]。研究表明：尽管在衰老过程中造血系统的基本成分得以维持，但造血干细胞的数量和质量是逐渐降低的[4-5]。
造血干细胞的连续移植是建立造血干细胞体内衰老最常用的模型。研究发现，造血干细胞连续移植数代后，供者造血干细胞逐渐失去在受者体内重建造血能力，供者衍生的干细胞在移植中逐渐减少，克隆生成潜能下降，竞争性再生能力降低和外周血恢复延缓，最终导致受者死亡，这表明连续移植中造血干细胞数量不断减少和功能逐渐衰竭[6-8],并发现供者衍生的干细胞在连续性移植中产生淋巴样细胞的能力下降，向髓样细胞分化的能力增强，这与衰老过程中淋巴细胞减少而髓样细胞仍保持相对恒定有关[9]。现有的造血干细胞衰老机理有外界损伤和遗传调控两种学说，研究表明，端粒缩短，端粒酶活性下降[10]，细胞记忆相关蛋白及p16INK4a等表达改变参与造血干细胞衰老的调控[11-12]。
3.2 造血干细胞衰老常用的实验研究方法及其意义6 [' k) f: _' E1 @3 _
3.2.1 造血干细胞衰老模型的建立造血干细胞连续性移植是迄今建立造血干细胞衰老体内模型及检测其衰老最常用的方法[2]。取雄性供者的骨髓或外周血经免疫磁珠或流式细胞术分选后得到高纯度的造血干细胞，将其输注给受致死剂量射线照射的雌性受者，4～6个月后从第一受体骨髓中分离纯化造血干细胞，进行Y染色体常规分析，Y染色体细胞的百分比可以显示受体骨髓中供体衍生的细胞量，以此确定移植供体细胞在受体内重建造血功能的作用，并将供体来源的造血干细胞在体外干细胞培养体系中培养扩增，通过种植单位数量细胞所扩增的细胞数鉴定供体细胞的自我更新能力，在半固体培养体系中进行定向诱导分化培养，通过种植单位数量的细胞所生成粒系与红系祖细胞数鉴定供体细胞的多向分化能力。照此方法进行不断地连续性移植，同时观察移植过程中受体存活情况。在连续移植过程中，每次移植后由供者衍生的造血干细胞在自我更新和多向分化能力上均下降，在有限移植代数后受体死亡，说明连续移植过程中造血干细胞逐渐衰老。移植后衰老造血干细胞的检测可采用流式细胞术进行细胞周期分析，计算衰老造血干细胞周期各时相点变化，并进行β-半乳糖苷酶染色。衰老造血干细胞 G1期细胞比例升高，说明造血干细胞脱离静止状态进入细胞周期，随静止状态造血干细胞的减少最终导致干细胞和骨髓衰竭，同时β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显升高进一步说明干细胞的衰老。通过造血干细胞自我更新和多向分化能力检测，细胞周期分析，衰老相关酶化学测定建立细胞衰老模型[13-17]，利用此模型可以研究造血干细胞衰老的机制和延缓衰老的途径。
3.2.2 衰老造血干细胞端粒及端粒酶的检测端粒是真核生物线性染色体末端重复DNA序列和蛋白质结合形成的复合结构，端粒缩短被认为是触发细胞衰老的分子钟，可作为细胞衰老的标记。端粒长度由端粒酶维持，衰老细胞端粒缩短，端粒酶活性下降[18-19]。
Southern Blot结合端粒重复序列扩增法（TRAP）-非放射性酶联免疫吸附测定（ELISA）是检测端粒长度和端粒酶活性的常用方法。Southern Blot技术用于基因组DNA特定序列的定位,可用于固定DNA，并分析DNA结构。连续性移植实验中，每一次移植后分离供者衍生的造血干细胞染色体DNA，运用Southern Blot技术检测DNA的大小及含量，以此计算端粒的长度，并比较移植前后端粒长度的变化。端粒长度可反映造血干细胞衰老情况，每一次移植后端粒缩短证明造血干细胞衰老，这与损伤的功能相一致，并在连续移植过程中快速的端粒缩短引起细胞衰老的加速。端粒酶活性常用TRAP-ELISA法检测，首先分离纯化移植后供者衍生的造血干细胞，通过TRAP循环扩增端粒重复序列，产物经ELISA检测，判定端粒酶功能活性，并比较移植前后端粒酶活性的改变，每一次移植后端粒酶活性下降说明造血干细胞衰老，从端粒酶不足的老鼠体内分离而来的造血干细胞仅能连续移植2次，并伴有造血干细胞端粒缩短的加速和长期再生潜能的降低。连续性移植实验中端粒缩短和端粒酶活性下降证明端粒及端粒酶参与造血干细胞衰老的调控[20-23]。
3.2.3 衰老造血干细胞相关蛋白表达改变的检测造血干细胞衰老过程中伴有相关蛋白表达的改变。Western Blot是一种识别和定位蛋白质的技术，以蛋白质与特异抗体的结合能力为基础，通过标记的二抗显色，检测蛋白水平的表达。连续性移植实验中，将造血干细胞衰老相关的某一蛋白作为检测物，运用Western Blot检测其移植前后的表达，若该蛋白在移植后表达改变，则说明其参与造血干细胞衰老的调控。研究显示，受照射的受者鼠体内周期依赖性蛋白激酶抑制剂（CKI）p21Cip1/Waf1 (p21)缺失导致造血衰竭加速，而另一种特殊的CKI p18INK4C (p18)缺失，体内造血干细胞自我更新能力增强[13]。周期素依赖性蛋白激酶（p16INK4a）是细胞周期控制中涉及的一种蛋白质，依赖年龄表达，p16INK4a是导致造血干细胞衰老的信号分子基础，其在连续性移植过程中表达增高，p16INK4a的缺失使造血干细胞再生能力缺陷和程序性细胞死亡减轻，并改善连续性移植中细胞应激耐受力和动物存活率[12]。Kamminga等[11]研究报道，细胞记忆机制参与造血干细胞衰老的调控，细胞记忆的分子基础PcG和TrxG蛋白在衰老的造血干细胞发生改变。造血干细胞衰老相关蛋白表达的检测是造血干细胞衰老机理研究的一项重要方法[3，24]。
3.2.4 造血干细胞衰老相关基因表达的检测造血干细胞衰老遗传调控学说的研究显示，在造血干细胞衰老过程中存在相关基因表达的改变，许多研究运用基因芯片结合反转录－聚合酶链反应(RT-PCR)检测衰老造血干细胞相关基因表达的改变[25-27]。RT-PCR 是一种分析基因表达的快速灵敏的方法，提取组织或细胞中的总RNA，通过反转录酶反转录成cDNA，进行PCR 扩增，检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。RT-PCR只能对少数几个基因的表达进行分析，而基因芯片技术可获得样品中大量基因序列及表达的信息。基因芯片又称DNA芯片或DNA微矩阵，其在固相载体芯片上固定了大量的基因探针，形成DNA微阵列，样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增等技术摻入荧光标记分子与DNA微阵列杂交后，通过荧光扫描器及计算机分析，即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。Chambers等[28]对小鼠纯化的造血干细胞的14 000多个基因进行微矩阵分析显示：1 600个基因是衰老诱导的，而1 500个是衰老抑制的，Rossi等[9]研究表明：907个基因是衰老相关的，在调控淋巴系结构和功能中发挥重要作用的43种基因，有70%被发现在衰老的造血干细胞中下调；而调控髓系结构和功能的38种基因，有76%被发现在衰老的造血干细胞中上调，二者共同作用致使衰老过程中造血干细胞分化发生谱系偏移，由此提出谱系相关基因的不同表达是造血干细胞衰老的一种内在的潜在的分子特征。
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4 结论
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造血干细胞衰老是一个受多因素调节的过程，遗传和后天调节机制在造血干细胞衰老和造血系统衰老中发挥重要作用。通过造血干细胞连续性移植、自我更新和多向分化能力检测，细胞周期分析、β-半乳糖苷酶测定建立细胞衰老模型，并运用Southern Blot、Western Blot、RT-PCR、基因芯片等方法进行造血干细胞衰老相关指标的检测已取得显著的研究成果，但应该看到造血干细胞衰老的机制还不甚清楚，例如：有研究提出端粒的特殊分子变更比端粒长度在造血干细胞衰老过程中的作用更重要 [29-30]。因此造血干细胞衰老机制还待更深入研究，其研究方法仍需进一步完善，才能用更确切的实验数据阐述并证明造血干细胞衰老的机制。随着社会的发展和医学的进步，确保老年人健康长寿、延缓衰老已成为全世界关注的问题。虽然衰老是无法抗拒的,但延缓衰老却是可能的，目前已有许多研究涉及对造血干细胞衰老的干预及调控机理。因此对造血干细胞衰老机制的研究将助于更深入阐述造血干细胞和衰老的生物学，并为延缓造血干细胞衰老的研究打下坚实的理论基础。

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作者: 兔儿乖 时间: 2009-1-20 20:55

收藏了，很好

作者: yangbin221 时间: 2009-2-7 15:02

这个是我师姐的文章，我们的课题组就做这个

作者: laolifeidao999 时间: 2010-4-6 00:00

Thanks.

作者: 开国大典 时间: 2010-4-19 13:37

我师姐的

作者: sk582755180 时间: 2010-4-22 15:17

楼上师兄哈哈

作者: yuleiyu7788 时间: 2010-5-8 20:31

收藏了，很好

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