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标题: 干货，多能干细胞冻存/解冻标准流程！ [打印本页]
作者: 加拿大STEMCELL    时间: 2018-10-18 16:49     标题: 干货，多能干细胞冻存/解冻标准流程！

本帖最后由 加拿大STEMCELL 于 2018-10-18 16:57 编辑 - w0 E$ j0 H) ?$ l1 C! A
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多能干细胞的冻存和解冻
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' P3 h0 ~& I  Y) ?上期hPSC维持培养专题的微信我们介绍了如何对mTeSR™1培养的人多能干细胞进行传代。在mTeSR™1维持培养的人多能干细胞可以用mFreSR™和Cryostor® CS10进行聚集体冻存，也可以用FreSR™S进行单细胞冻存。这两种冻存方法都可适用于使用聚集体传代技术进行的常规传代。我们推荐使用聚集体冻存hPSC，可以最大限度的保证细胞的活力和核型的稳定，作为hPSC维持培养专题的最后一期，今天我们就来重点介绍细胞聚集体冻存和解冻的标准化流程：& R' d6 G1 D& K# q! v; R
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解冻复苏方案适用于在冷冻保存之前在mTeSR™1中维持培养的人ES和iPS细胞。对于其他方案培养的细胞（例如使用饲养层细胞或其他条件培养基，或无饲养层培养基如TeSR™E8™或TeSR™2），应当使用冷冻保存之前相同的培养基和条件下进行解冻。复苏后，细胞可以转换到mTeSR™1培养基。
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mFreSR™（产品号 #05854）是一种成分确定、无血清的冻存液，专门为在mTeSR™1中培养的人ES和iPS干细胞设计。为即用型且含冻存保护剂。1 k" C; Z( S8 G3 Y6 n$ m7 |9 F
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图1. 与其它已报道的方法相比，mFreSR™的复苏效率提高了5-10倍
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使用mFreSR™冻存如图所示代数的H9 hESCs。复苏效率使用复苏后存活的克隆计数分析。
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# v1 c$ h1 f; W+ n4 s5 p; WCryostor® CS10（产品号 #07930）是一种无动物成分的广谱细胞冻存液，cGMP级别，为即用型且含冻存保护剂。
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注意：开盖之前，用70%的乙醇或异丙醇擦拭瓶身。
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9 ^) W6 k. g& x以下说明适用于在mTeSR™1中培养的6孔板培养物的冻存，使用mFreSR™ 或CryoStor® CS10皆可。培养物应该在适合传代的时候进行收集和冻存。每管所含有的细胞应当来源于6孔板的1个培养孔。如果使用其他的培养器皿，请相应的调整体积。" D) x9 G! r$ c, d0 P
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注意：如果使用mFreSR™，融化所需量的mFreSR™然后放置于冰上。9 _3 K9 J- h( o. b3 x
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（1） 用无酶方法进行传代至第8步，或者用有酶传代方法至第10步。2 N4 L* a8 P1 v# W! \
（2） 在室温（15 - 25°C）以300 x g离心5分钟。5 r# F4 h: v) S6 P& F2 H
（3） 轻轻吸走上清液，注意不要扰动细胞团。
3 C3 R' d" s1 G（4） 用血清学吸管以1 mL的mFreSR™或CryoStor® CS10重悬细胞。在打散细胞团时，尽量减少细胞聚集体分解。, A+ b. t+ @( L# t
（5） 用2 mL的血清学吸管将1 mL的细胞聚集体转移到标记好的冻存管中。$ W  D% f, c9 `5 Q, e
（6） 用以下方法冻存细胞聚集体:9 ]; N- G9 B( I9 Q; h* Z  q

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7 t3 L( w1 q3 F: a2. 解冻
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人ES和iPS细胞在解冻后，应该立即铺板在预先包被好的培养皿中。上述冻存的一管细胞可以成功的铺板到6孔板的 1 - 2孔。* C! `0 V" L& U3 U' u8 m. M! l' \

" b" C- e  }# l7 b（1） 开始之前，提前准备好以下材料：试管，恢复到室温的mTeSR™1（15 - 25°C），及预先包被的培养板，确保整个解冻复苏程序可以在最短的时间内完成。! |# I1 w2 G! p9 V' f& K8 i+ n
注意：不要在37°C水浴中加热mTeSR™1 培养基。8 H1 H. U+ l' o1 u! f& ^# d
（2） 在37°C水浴中快速解冻，持续温和的在水中晃动冻存管，直到剩余少量细胞还处于冻存状态。( M# S: P" X( p0 P
（3） 从水浴中取出冻存管，用70%的酒精或异丙醇擦拭除菌。% |6 Y5 ~( P$ w! d/ {* ]  K
（4） 用2 mL的血清移液管把细胞悬液转移到一个15 mL的锥形试管。
: }+ _) R1 t  t) S/ w+ [1 P6 X注意：用2 mL的血清移液管代替1 mL的枪头可以减少细胞聚集体的分解。9 k6 Q: W6 s4 p$ [$ j) w
（5） 逐滴加入5 - 7 mL的预热的mTeSR™1培养基到15 mL的离心管中，加入的同时轻轻混匀。/ U4 U0 Z: h( L5 ^) S7 P
（6） 室温（15 - 25°C）以300 x g离心5分钟。
+ K, F' D7 i3 ?/ n9 O/ [（7） 吸出培养基，使细胞沉淀完好无损。 使用2 mL血清移液管轻轻将细胞沉淀重悬于1 mL的mTeSR™1中。小心保持细胞作为聚集体。
4 \6 j! [  |, s* U! m- ?8 s7 N（8） 将0.5 mL的细胞混合物转移到含有mTeSR™1的预包被的6孔板的培养孔中（例如，每个冷冻管可以铺板两个孔）。3 r! X0 N/ o& I5 v% u
注意：铺板多少孔可能需要根据冻存的细胞聚集体数量进行调整。通常在复苏后，要比在常规的传代铺板更多的细胞聚集体数量。
+ b. @3 h* G3 |- H) p（9） 将培养板放入37°C培养箱。快速前后左右的摇晃培养板数次，将细胞聚集体分布均匀。24小时内不要移动培养板。
0 q% R+ h' @& f! |3 K6 x  o; ?注意：不均一的聚集体分布可能会导致人ES和iPS细胞分化增加。6 Y0 i  H0 ~# ^; H: D# z! c8 z
（10） 用mTeSR™1每天换液，目测培养物以评估生长状态直到下一次传代。解冻复苏后的6 - 7天，查看是否有适合传代的（中心致密的）未分化的集落。
& b6 ], H) D/ R! e( b- _& C" e注意：解冻复苏后如果只能观察到少数的未分化的集落，只选取这些未分化的集落进行传代，并将它们铺板至相同大小的新包被的培养孔（不进行稀释传代）。3 i% ]* i$ M6 e7 ^% R2 M9 B& B

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欲了解更多有关干细胞培养的相关内容，包括如何使用FreSR™S进行单细胞冻存/复苏，请参考我们的技术手册：在mTeSR™1中维持培养人多能干细胞。您也可以点击这里申请纸质版操作手册。想了解更多关于多能干细胞的知识？您也可以点击这里申请我们与Nature Reviews Molecular Cell Biology合作的精美挂图 - Stem Cell States - Naive to Primed Pluripotency。. U+ _* A# v6 v2 y' O
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