干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 科研求助!--(!) [打印本页]

作者: kqyy 时间: 2010-4-26 10:13 标题: 科研求助!--(!)

小弟是用人骨髓培养人的骨髓间充质干细胞的,效果很差.我取2-4毫升骨髓枸椽酸盐抗凝,种到25平方厘米的玻璃瓶中,48-72小时初次换液时几乎什么都没有.
问题一:抗凝剂枸椽酸盐损伤细胞,导致细胞活力受损.
问题二:运输保存，我用一个泡沫保温盒子，里面没有加冰，估计里面的温度２０几度吧．
　　问题三：抽取的骨髓液太少，种的面积太大．２－４毫升种２５平方厘米的玻璃瓶．6 |/ Q1 v1 n: s0 }* @! m+ ~
　问题四：血清浓度问题．我一直用ＤＭＥＭ＋进口１０％ｆｂｓ，有人建议我用１５％的血清，我曾经有一批用２０％的血清养出来了。
　问题五：培养箱的原因。我一直在一个培养相养。里面肿瘤细胞和各种原代细胞都有人养，另外培养相的各种参数是否正确等。

作者: 宝贝一家亲 时间: 2010-4-26 11:07

对于抗凝剂的影响我不太清楚0 K6 {$ C+ Z& F0 s0 p
但是我可以给你后面几个问题提出我的看法  希望对你有帮助
运输保存最好是在冰上而且最好拿到以后最短的时间里分离出细胞进行培养! \' E  Q% d+ e* I! [4 L
培基可以尝试提高血清至15%，另外我们一般养原代会添加非必需氨基酸我不知道你们的培基里是否需要添加
还有是否需要添加其他因子5 J1 M7 X9 ?  C, A# N: l( }
接种细胞密度也很关键合适的密度 4 L8 R5 z3 \/ C0 m5 }3 V
太稀的话细胞很难长起来 ! }3 c; Q2 C! E) q
培养箱的话如果其他细胞培养都没有问题那么培养箱就没有问题

作者: tnfsf10 时间: 2010-4-26 11:39

回复 2# 宝贝一家亲
) h& E; @& K3 t$ `* z
( x) @2 b% ~1 _; e( ?
1.抗凝剂最好使用肝素钠抗凝。（12500U肝素钠/100ml生理盐水溶解）与骨髓1：1
2.原代培养时候，骨髓分离出来的单个核细胞，一般建议2*10 5次方/cm2接种，24到48小时半量换液。一般来说，MCS贴壁很快的，不需要24小时。如果看到的很少，可能是MCS很少。我观察的48小时后可以明显看到纤维状细胞，换液的上清使用新的培养瓶培养，基本没有纤维状细胞出现。
3.我现在的问题也是，原代细胞生长缓慢，不知道有没有好的方法加快细胞分裂。我没有添加生长因子的。
希望和大家一起学习！

作者: 烂桃 时间: 2010-4-26 15:16

放置时间长会有影响，我做的首次半换液72h，原代的可以用15%FBS，我个人认为BMSC还是比较好养，抽出后时间长的话可以肝素钠抗凝，时间段就不需要，加培养液稀释离心，重悬接种后三天后半换液，在两三天全换液，差不多一个星期到十天左右就能长满，不过前几天最好不要经常拿出来看，会对细胞贴壁有影响，我一般前三天都不动它的

作者: 烂桃 时间: 2010-4-26 15:37

2-3ml骨髓，主要用全骨髓贴壁，密度梯度离心也用过，但是形态不如全骨髓的好，10 8次方首次接种的话10cm的培养皿2×106\个，原代培养我有时加一些生长因子

作者: 5784630 时间: 2010-4-26 19:21

回复 5# 烂桃
! _( P/ o% z, U% W, a

楼上，你好，能给我发一份全骨髓贴壁法的protocol吗？- t% o- S' n) ^" u) T
我的QQ:1005139063
非常感谢

作者: kqyy 时间: 2010-4-26 19:54

请问版主"烂桃"的疑问:1 A. `, [; ]# {2 z
1、关于抽取骨髓的体积的问题，多少毫升种多大的瓶。多大的密度种什么瓶。. L. u+ j I* z& q
2、培养基稀释是完全培养基还是基础培养基呢？

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)